‘京白梨’優良單株組織培養高效快繁體系構建

劉 春，高同雨，蘇本營，李錦錦，李 晶，武雅娟，王 巍，沈應柏

（1.北京市門頭溝區國家生態修復科技綜合示范基地，北京 102300；2.淮北師范大學，安徽淮北 235000；3.北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083）

‘京白梨’屬于秋子梨（Pyrus ussuriensis）的一個優良品種，是北京市地理標識性水果之一，栽植歷史悠久，迄今已有400多年。在北京的栽培區域主要包括門頭溝區妙峰山鎮、軍莊鎮和房山區琉璃河鎮等，在我國的河北、遼寧、山西等地也有栽培?！┌桌妗麑嵖谖都毮仾毺兀蔷哂兄匾獌r值的水果品種，深受廣大消費者喜愛。隨著‘京白梨’在市場上供不應求，其市場價格也在逐年提高，給北京‘京白梨’產區帶來了良好的經濟效益。但是由于病害、栽培管理粗放、不注重保存優良種質資源等原因，目前‘京白梨’品種退化日益嚴重，出現風味變淡、果形較小、畸形果增多等現象[1]，嚴重制約了其產業化發展，急需通過科學技術手段加快‘京白梨’優良植株繁育。

20世紀30年代，Tukey進行了梨胚胎培養并獲得成功[3]。梨及其砧木的繁殖多采用嫁接方法，70年代后關于梨與砧木的組織培養和離體快繁的報道增多，美國和意大利最早使用離體快繁技術對梨及砧木進行商業性生產。1975年，前蘇聯學者進行洋梨幼胚培養獲得植株[3]。David與趙惠祥從莖尖培養中，分別得到試管苗和完整的植株。此外還進行了下胚軸，子葉橫切段的培養，都成功獲得了不定芽[3]?，F階段梨的組織培養工作主要集中在葉片培養和莖尖培養兩個方面。研究結果表明，品種和器官的外植體不同，所采用的培養基種類、植物生長調節劑的比例和濃度、培養條件也不同。不同的培養基條件對梨的組織培養有很大影響，韓繼成等[4]通過試驗表明，梨的兩個品種冀蜜和豐水分別以N6，NN60，MS為培養基，附加相同的條件（TZD1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+CH 250 mg/L+S.30 mg/L+A.5 mg/L），結果在NN60培養基上獲得了最佳效果，不定芽的誘導率為100%。

目前對‘京白梨’優良單株組織培養快繁技術的研究報道較少，研究‘京白梨’的組織快繁體系，包括消毒方式、外植體篩選以及增殖和生根培養基配比，具有一定的生產實踐意義。通過組培快繁技術獲得脫毒苗，可以減少梨樹自身潛隱病毒帶來的危害，為‘京白梨’優良植株種質資源保存和繁育提供理論基礎和技術支撐，同時，也可為解決北京地區‘京白梨’品種退化提供有效途徑，從而推動‘京白梨’產業化發展。

1 材料和方法

試驗于2018年4月至2019年6月在北京市門頭溝區科技開發試驗基地組培實驗室內進行。

1.1 試驗材料

植物材料：選用‘京白梨’優良單株‘孟3’為試驗材料，外植體選用枝條水培萌發出的幼嫩芽尖和春季樹體萌發的幼嫩新梢。

化學藥劑及材料：75%酒精、2%次氯酸鈉、瓊脂糖、MS培養基、NAA、IBA、IAA、GA3、蔗糖、氫氧化鈉、鹽酸、蒸餾水、抗壞血酸、活性炭、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、蛭石、營養土。

1.2 試驗處理與方法

1.2.1 外植體消毒方式篩選

采集‘京白梨’優株‘孟3’枝條，經水培抽芽后，每個瓶內接種3個‘京白梨’花芽和葉芽，5瓶為一個生物學重復，14 d后觀察外植體污染結果。采用2%的次氯酸鈉和0.1%的升汞溶液進行消毒處理。

1.2.2 組培外植體篩選

外植體采用帶芽的越冬枝條以及水培抽出的花芽，接種到相同的培養基中，觀察生長情況，統計污染率。

1.2.3 花芽愈傷組織培養基篩選

采用以下MS和1/2 MS兩種培養基配制方法，30 d后觀察花芽愈傷組織誘導情況。

表1 不同培養基花芽愈傷組織誘導處理Tab.1 Treatment of callus induction of flower buds in different mediums

1.2.4 ‘京白梨’組培快繁培養基優化

外植體選用‘京白梨’水培萌動的嫩芽，設計不同條件的培養基，包括MS類型，不同激素及濃度處理，通過觀察組培苗增殖生根情況，篩選出最優培養基方案（表2、3）。

表2 組培苗增殖不同激素處理Tab.2 Different hormone treatments for proliferation of tissue culture seedlings

1.2.5 數據處理方法

通過Excel 2013進行數據的整理計算；采用DPS 7.05統計軟件進行方差分析，采用單因素方差分析各處理差異的顯著性水平，采用最小顯著差數法（P＜0.05,LSD）進行不同處理間均值的顯著性差異比較。

污染率（%）=（污染外植體/接種外植體總數）×100；分化率（%） =（已分化的外植體數/接種外植體總數）×100；增殖率（%）=（處理后的有效芽數/接種外植體總數）×100。

2 結果與分析

2.1 外植體消毒方式對污染率的影響

外植體接種14 d后觀察結果，采用2%濃度次氯酸鈉的消毒方式污染率為33%，采用0.1%升汞的消毒方式污染率為18%。

表3 不同激素處理下‘京白梨’組培苗生根的培養基Tab.3 Mediums for rooting of tissue culture seedlings of‘Jingbaili’treated with different hormones

2.2 不同外植體的接種對比分析

外植體直接采用帶葉芽及花芽的老枝條，經消毒接種到培養基后污染率達到93.3%；而選用新發的花芽及嫩芽試驗，污染率為0?！┌桌妗M培試驗中外植體的選擇應避免使用老枝條，盡量選用剛萌動的嫩梢和花芽。

2.3 不同培養基對花芽愈傷組織形成的影響

在1/2 MS培養基中的‘京白梨’花芽外植體形成的愈傷組織比MS數量多，MS愈傷組織分化率為33.3%，在1/2 MS培養基中愈傷組織的分化率為60%。但是在1/2 MS中的愈傷組織出芽率較低。

2.4 赤霉素濃度對花芽愈傷組織誘導的影響

30 d后觀察外植體生長狀況，結果表明花芽在3 mg/L（圖1b）和1.5 mg/L（圖1c）赤霉素濃度中均能誘導出愈傷組織，其中在1.5 mg/L濃度中生長良好，愈傷組織誘導個數較多，45 d后花芽愈傷組織分化出完整植株（圖1a）。

圖1 不同濃度赤霉素的‘京白梨’培養情況Fig.1 Culture of‘Jingbaili’with different concentrations of GA3

2.5 組培快繁技術培養基的優化

2.5.1 激素處理濃度對嫩梢外植體愈傷組織增殖的影響

不同處理間組培苗生長情況（表4），愈傷組織個數以T3、T9處理最高，約10個，其次為T6、T4處理，約為9個，與CK相比具有顯著性差異；不定芽個數以T6處理最高，約為14個，其次為T3，約為13個，與CK相比具有顯著性差異；增殖率以T6、T3處理最高，分別為94%、92%，顯著高于CK；芽長度以T2、T4、T5處理最大，均為0.58cm，與CK相比具有顯著性差異。

綜合以上指標以及組培苗后期生長情況（表5），采用3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L GA3培養基最有利于組培苗增殖。

表4 不同激素處理對‘京白梨’外植體組培苗生長影響Tab.4 Effects of different hormone treatments on explants growth of‘Jingbaili’

表5 不同激素處理的‘京白梨’外植體組培苗30 d生長特征Tab.5 Growth characteristics of‘Jingbaili’explants treated with different hormone treatments for 30 days

2.5.2 激素處理濃度對組培苗生根的影響

組培苗生根試驗主要是通過NAA、IAA、IBA不同生長激素的濃度處理，以及使用不同類型的MS（MS、1/2 MS、1/4 MS）接種。

S3、S5、S7、S9生根培養基中，在15 d觀察期內，發現組培苗基部有根原基形成，但在此期間未誘導形成根。其中1/4 MS培養的‘京白梨’組培苗葉片在生長過程中出現發黃的現象。

45 d觀察后（圖2），S10、S11培養基中的‘京白梨’組培苗成功誘導生根，NAA激素濃度控制在0.5～1范圍內都可以促進根系生成，但形成的根系較脆，移栽時容易斷裂。

圖2 ‘京白梨’組培苗誘導生根生長情況 （45 d后）Fig.2 Rooting growth of'Jingbaili'tissue culture seedlings（45 days later）

3 討論

植物不同部位器官發育程度、遺傳因素等生理狀況存在一定差異性，因此，不同器官組織的外植體增殖系數存在一定差異性，多則可分化5～6個芽，少則分化1～2個芽，甚至無增殖現象。適宜外植體的選擇對離體組織培養成功至關重要，王萍等[5]以馬鈴薯的幼葉、莖段、微型和種薯的塊莖為外植體進行誘導愈傷組織和植株再生試驗，結果表明馬鈴薯的分化率在不同外植體間差異較大。本研究發現，選用‘京白梨’優良植株老枝條為外植體進行接種污染率顯著高于嫩梢，因此在外植體的選擇上應盡量采用‘京白梨’植株幼嫩組織，如花芽或剛萌發的嫩梢。植物不同外植體分化成芽體的時間也存在較大差異，陳桂敏等[6]利用蝴蝶蘭的莖尖、根尖、葉片、花、花梗等外植體進行組培繁殖，發現不同外植體的增殖速度和增殖系數各有差異，其中花梗誘導花梗腋芽效果最佳，其它部位不能誘導原球莖。本研究發現，‘京白梨’優良植株花芽愈傷組織分化成芽體的時間與嫩梢相比較晚，且不同器官的外植體增殖部位有差異性，有的從側芽增殖，有的從基部愈傷組織增殖。

篩選合適的培養基對植物組織培養具有重要意義。不同的培養基對外植體愈傷組織的誘導情況是有所差別的，如MS培養基容易誘導出愈傷組織，而B5培養基只能夠形成芽點和根。高疆生等[7]對1/2 MS、MS等幾種培養基的梨外植體芽增殖率作了比較，發現MS培養基增殖率為15%～25%，1/2 MS培養基為70%。本試驗結果表明采用1/2 MS培養基有利于‘京白梨’花芽愈傷組織的形成，但MS培養基有利于組培苗后期生長，原因可能是前期的愈傷組織對MS大量元素要求不高，但后期組培苗的生長需求MS量加大，以支撐苗株后期生長。

外源激素作為植物主要的生長調節劑，對組培苗的誘導分化、增殖和生根起到關鍵性的作用。在梨的組培試驗中，愈傷組織的形成、芽的分化、增殖系數與外源激素的種類、濃度及各激素間的配比有很大關系[8]。本試驗中，發現1.5 mg/L濃度GA3可能對組培苗的生長有一定影響，低濃度的生長調節劑NAA能促進莖干的分支。本試驗中6-BA、NAA、GA3不同配比對梨的增殖效果明顯，結果表明在6-BA濃度不變的條件下，降低NAA濃度、提高GA3濃度或提高NAA濃度、降低GA3濃度均能促進梨組培苗的增殖。外源激素梯度處理可在今后試驗中繼續優化，增加其它幾種激素的處理，如TDZ等，進一步觀察這些激素在不同水平下對組培苗生長的影響。

梨屬于難生根植物，只有極少數品種生根容易，絕大部分梨品種生根較難[9]。‘京白梨’誘導生根試驗中，S10、S11培養基中的‘京白梨’組培苗成功誘導出根系，證明在0.5～1 mg/L濃度范圍內的NAA適合‘京白梨’組培苗根系生長?！┌桌妗M培苗生根培養基S1～S9目前只能形成根原基，尚未成功誘導成根，梨組培苗生根條件比較復雜，與溫度、光照、激素水平、碳源等外界條件有關。

本研究構建‘京白梨’優良單株組織培養高效快繁體系，通過研究不同外植體、消毒方式，以及不同激素處理對組培增殖生根的影響，為‘京白梨’的離體培養提供理論基礎和科學依據。近階段，隨著基因工程和生物技術的廣泛應用，梨的離體培養在基因工程育種中應用逐漸增多[10-14]。梨組培過程中不易生根，很難在生產實踐中應用，且不同品種間的梨樹基因型的差異性[15-17]增大了梨樹離體培養體系構建的難度。因此，在今后的探索研究中，不斷改進組培技術，減少試驗成本，解決組培實際存在的問題將是今后努力發展的方向。

4 結論

選取水培枝條8～15 d后萌發的新嫩梢和莖尖作為外植體進行接種試驗，可有效減少污染率，提高‘京白梨’組培苗脫毒繁育成功率；‘京白梨’花芽愈傷組織在1.5 mg/L濃度赤霉素中生長良好，分化個數較多；采用3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L GA3培養基對‘京白梨’組培苗愈傷組織形成、不定芽生長個數、增殖率、芽長度、葉片生長情況均有良好的促進作用，其中T10培養基更有利于新生枝干的萌發；在生根培養過程中，S10、S11培養基中的‘京白梨’組培苗在45 d后成功誘導生根。因此，‘京白梨’優良單株組織培養快速繁育可以通過以植株幼嫩組織作為外植體、以2%的次氯酸鈉作為消毒劑、采用3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L GA3作為增殖培養基、S10和S11作為生根培養基等來實現。