超聲波輔助提取多穗柯棕色素工藝優化

王 坤，李寶財，黃曉露，陳金艷，梁文匯，李開祥

（廣西壯族自治區林業科學研究院廣西特色經濟林培育與利用重點實驗室，南寧 530002）

許多合成色素被證明對人體有害，它們的使用已逐漸受到限制，充分利用資源豐富的天然食用色素已是大勢所趨[1]。目前，我國已把開發天然食用色素作為發展食品添加劑的一個重要方向。來源于動植物的天然色素，不僅安全性高，很多天然色素還具有較高的營養價值和藥理作用[2-4]，所以對天然色素的研究和應用具有廣闊的前景和發展潛力。超聲波是一種能產生強大能量且穿透力強的彈性波[5-6]，在溶劑提取中可在短時間內穿透植物細胞，在細胞內產生環流，從而提高有效活性成分的擴散和提取[7-8]，超聲波在溶劑中產生的強烈振動及空化效應可提高提取效率，有效縮短提取時間，使提取更為完全[9-10]。超聲波輔助提取方法具有很好的提取優勢，已被廣泛應用于植物有效成分的提取[11-14]。

多穗柯（Lithocarpus ploystachyus），又名甜茶[15]，系殼斗科（Fagaceae）櫟屬常綠喬木。以野生狀態分布于我國長江以南各省，資源非常豐富[16]。多穗柯作為一種藥食同源性植物，其含有豐富的黃酮類成分且具有很好的藥理作用[17-21]，而且其棕色素的含量很高，多穗柯棕色素著色能力強，溶解性很大，有較大的pH值適用范圍，對光、熱具有較高的穩定性，無毒副作用，是一種很好的天然食用色素資源[22-23]，因此，其具有很高的利用價值，為食品工藝提供一種價廉物美的棕色素天然資源。

目前，對于多穗柯棕色素的研究較少，且利用響應面法優化超聲波輔助提取多穗柯棕色素的研究未見報道。本試驗以多穗柯葉為原料，用超聲波輔助法提取多穗柯棕色素，研究提取劑NaOH溶液的濃度、提取溫度、提取時間及液固比等因素對多穗柯棕色素提取的影響，并通過響應面法優化了多穗柯棕色素的最佳工藝條件，以期為多穗柯棕色素的綜合利用以及多穗柯棕色素的產業化生產提供一個科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多穗柯新鮮葉：2014年10月份采摘于廣西南寧廣西林科院試驗基地。無水乙醇、氫氧化鈉、濃鹽酸均為分析純，水為超純水。

LAI-2200可見紫外分光光度計，LI-COR公司；TGL-18M高速低溫離心機，上海盧湘儀器有限公司；?，擠GX-9053BC-1電熱恒溫鼓風干燥箱，上海滬粵明科學儀器有限公司；CPA2245S電子分析天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；KQ-250DB超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；JP-400B電腦版中藥粉碎機，永康市久品工貿有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

將多穗柯新鮮葉置于40℃的烘箱中干燥、粉碎機粉碎，分別用60孔（邊長0.250 mm）和120孔（邊長0.125 mm）檢驗篩進行篩選，取檢驗篩中間部分為待測多穗柯葉樣品，置于-4°C的冰箱中保存。

1.2.2 工藝流程

準確的稱取多穗柯樣品若干份，每份0.25 g，分別在不同的影響因素下進行超聲輔助浸提，超聲頻率為40 kHz，然后6 000 r/min離心10 min，取濾液。重復操作3次，合并濾液，定容至50 mL容量瓶中，稀釋20倍后，利用紫外-可見分光光度計進行光譜掃描[24-25]，在410 nm處測定其吸光度值[23]。

1.2.3 色素提取劑的選擇

分別稱取0.25 g待測多穗柯樣品，按照料液比1∶20分別加入95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、2.0%NaOH、1.5%NaOH、1.0%NaOH、0.5%NaOH、蒸餾水、1%HCl等不同的提取劑，40℃下超聲提取30 min，然后5 000 r/min離心10 min，取濾液。重復超聲提取3次，合并濾液，定容至50 mL容量瓶中備用。

取上述不同棕色素提取液稀釋20倍后，在紫外分光光度計上于410 nm處測定吸光度，進行比較。

1.2.4 單因素試驗

（1）NaOH溶液的濃度對多穗柯棕色素含量的影響。在提取溫度50℃，提取時間2 h，液固比40∶1的條件下，將NaOH水溶液的濃度分別設定為0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，其余操作參照試驗1.2.2。

（2）提取溫度對多穗柯棕色素含量的影響。在NaOH水溶液的濃度為1.0%，提取時間2 h，液固比40∶1的條件下，將提取溫度分別設定為30、40、50、60、70℃；其余操作參照試驗1.2.2。

（3）提取時間對多穗柯棕色素含量的影響。在NaOH水溶液的濃度為1.0%，提取溫度為50℃，液固比40∶1的條件下，將提取時間分別設定為0.5、1、1.5、2、2.5、3 h；其余操作參照試驗1.2.2。

（4）液固比對對多穗柯棕色素含量的影響。在NaOH水溶液的濃度為1.0%，提取溫度為50℃，提取時間為2 h的條件下，將液固比分別設定為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1；其余操作參照試驗1.2.2。

1.2.5 多穗柯棕色素提取的響應面試驗

依據單因素試驗結果，采用Box-Behnken試驗設計設計3因素3水平的響應面分析試驗。以多穗柯棕色素提取液吸光度值為響應值，以堿液濃度（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、液固比（D）為中心點進行相應面分析。數據處理采用design expert 8.0.4軟件。

1.2.6 統計學分析

使用SAS軟件對數據進行統計學分析，每組試驗均重復3次，試驗數據為平均值。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

多穗柯棕色素在NaOH水溶液中有較好的提取效果（表1），但是濃度還不確定，所以通過單因素試驗研究不同堿液濃度對多穗柯棕色素提取的影響。

表1 不同提取溶劑的提取效果Ta.1 Extractive effect of different extracts

2.2 超聲波提取單因素最佳條件的確定

2.2.1 NaOH溶液的濃度對多穗柯棕色素含量的影響

隨著提取溶劑濃度的增加，多穗柯棕色素的提取得率隨之升高（圖1）。當提取溶劑濃度在0.1%～0.5%時，棕色素的提取得率直線升高；隨后隨著提取溶劑濃度增加，棕色素的得率趨于平緩；當NaOH水溶液的濃度為1.0%時，多穗柯棕色素的得率最高，吸光度值為0.613；當NaOH溶液的濃度超過1.0%時，吸光度值維持在一個較穩定的狀態。

2.2.2 提取溫度對多穗柯棕色素含量的影響

多穗柯棕色素的提取得率隨著溫度的升高而增加，當達到一定溫度時，溫度越高，棕色素得率反而有所下降（圖2）。當提取溫度為50℃時，多穗柯棕色素提取得率最高，提取液的吸光度值為0.623；當溫度超過60℃時，多穗柯棕色素的提取得率趨于穩定狀態。

圖1 不同NaOH濃度對多穗柯棕色素提取液吸光度的影響Fig.1 Effect of NaOH concentration on absorbance of brown pigment extract from Lithocarpus ploystachyus

圖2 不同提取溫度對多穗柯棕色素提取液吸光度的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on absorbance of brown pigment extract from Lithocarpus ploystachyus

2.2.3 提取時間對多穗柯棕色素含量的影響

隨著提取時間的增加，多穗柯棕色素的得率隨之升高，與時間成比例增加（圖3）。當提取時間超過1.5 h后，提取得率升高趨于平緩；當提取時間為2 h時，多穗柯棕色素提取得率最高，提取液的吸光度值為0.600，隨后隨著提取時間的增加，吸光度值反而緩慢下降。

圖3 不同提取時間對多穗柯棕色素提取液吸光度的影響Fig.3 Effect of extraction time on absorbance of brown pigment extract from Lithocarpus ploystachyus

2.2.4 液固比對多穗柯棕色素含量的影響

當液固比例由10∶1增加到20∶1時，多穗柯棕色素的得率呈直線上升；液固比由20∶1增加到30∶1時，多穗柯棕色素得率緩慢升高；液固比由30∶1增加到80∶1時，棕色素的得率先呈比例升高，后緩慢下降，趨于平緩（圖4）。液固比為60∶1時，多穗柯棕色素提取得率最高，提取液的吸光度值為0.703。

圖4 液固比對多穗柯棕色素提取液吸光度的影響Fig.4 Effect of liquid to solid ratio on absorbance of brown pigment extract from Lithocarpus ploystachyus

2.3 超聲波法提取多穗柯棕色素的響應面試驗

2.3.1 數學模型的建立與檢驗

根據單因素試驗結果，選取對多穗柯棕色素提取影響較為顯著的NaOH水溶液的濃度（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）、液固比（D）等4個因素，利用design expert軟件根據Box-Behnken設計原則設計試驗，選取堿液濃度、提取溫度、提取時間、及液固比進行試驗因素與水平的設計（表2）。

表2 多穗柯棕色素提取的試驗因素與水平設定Tab.2 Experimental factor and level design of brown pigment extract from Lithocarpus ploystachyus

按照相應面設計的因素和水平表，以A、B、C、D為自變量，以吸光度值為響應值（y），試驗方案及結果見表3。

表3 多穗柯棕色素提取的Box-Behnken試驗設計與結果Tab.3 Testing program and results of brown pigment extract from Lithocarpus ploystachyus

根據表3中所得數據進行二次多元回歸分析，得到響應變量（堿液濃度A、提取溫度B、提取時間C、及液固比D）與響應值（吸光度值y）之間的多元二次回歸方程。

y=0.73-0.024A+0.066B-0.0035C-0.081D-0.0015AB+0.02AC+0.037AD-0.028BC+0.042BD+0.06CD-0.069A2-0.025B2-0.092C2-0.072D2

對二次多元回歸方程各項進行方差分析（表4）。該回歸模型極顯著（P＜0.01）?；貧w模型的決定系數為R2=0.943 0，失擬項P=0.112 7＞0.05，失擬性檢驗結果不顯著。說明該模型與數據擬合程度較高，實驗誤差小，可以用該模型分析和預測超聲法提取多穗柯棕色素的結果。此模型預測了堿液濃度A、提取溫度B、提取時間C、及液固比D對多穗柯棕色素提取液吸光度值的影響，A、B、D、AD、BD、CD、A2、C2、D2為顯著影響因素，其中影響最大的因素是提取溫度和液固比，其次是堿液濃度，影響最小的是提取時間。

表4 多穗柯棕色素提取的回歸模型方差分析Tab.4 Analysis of variance for fitted regression model of brown pigment extract from Lithocarpus ploystachyus

2.3.2 多穗柯棕色素提取的響應面分析

為考察各個因素交互作用對吸光度的影響，在其他因素條件不變的情況下，分析交互作用對超聲波輔助提取多穗柯棕色素效果的影響作用。

在試驗設定的各因素水平范圍內，隨著各個因素取值的增大，響應面對應值也增大；當響應面值增大到極值后，隨著各個因素取值的增大，響應值逐漸減?。▓D5）。比較各因素交互作用對吸光度值影響的響應面圖可知，提取溫度和液固比對多穗柯棕色素的提取影響最為顯著，表現為曲線陡峭，隨其取值的變化，響應值變化較大；其次是堿液濃度，而超聲提取時間對提取多穗柯棕色素的影響表現為曲線較平滑，隨著取值的變化，響應值變化較小。在交互項中，對吸光度值的影響中，提取時間和液固比的交互作用對多穗柯棕色素的提取效果影響最為顯著。

由Design Expert軟件得到超聲波輔助提取多穗柯棕色素的最佳提取條件：NaOH水溶液的濃度為0.81%，提取溫度為60℃，提取時間為1.81 h，液固比為54.67∶1，在此條件下多穗柯棕色素提取液的理論吸光度值為0.798。

2.4 驗證試驗

為驗證模型的有效性，按照選擇的最佳工藝進行驗證試驗，比較試驗值與預測值得吻合度?？紤]到實際操作的情況，將最佳工藝條件修正：多穗柯待測樣品與濃度為0.8%的NaOH溶液按照55∶1的液固比混合，于60℃的溫度下超聲提取1.8 h。在此條件下，進行3次平行試驗，得到多穗柯棕色素提取液的平均吸光度值為0.792，與理論預測值的誤差僅為0.4%。然后按下面條件進行試驗：NaOH水溶液的濃度為2.0%，提取溫度為80℃，提取時間為3 h，液固比為80∶1，吸光度值為0.784。說明采用響應面法得到的優化結果可靠。

圖5 各因素交互作用對吸光度值影響的響應面Fig.5 Response surface of effects of various factors on absorbance values

3 結論與討論

多穗柯作為藥食同源性植物，其棕色素的含量很高，是一種很好的天然食用色素資源。上世紀80年代廖代福等[26]采用堿提酸沉法提取分離并且純化得到多穗柯棕精制品，并對得到的多穗柯棕的理化性質進行分析，發現其具有耐熱性、著色力強并且適用于中性及堿性環境中，經毒性試驗證明其食用安全性高。90年代廖曉峰等[23]對多穗柯提取食用棕色素進行了工藝研究，并對其理化性質和安全性進行了評價，本研究僅對水浸提法和萃取法進行了初步比較，未對其工藝進行優化研究。本試驗利用響應面法對超聲波提取多穗柯棕色素的工藝進行了優化，建立的二次多項式數學模型具有顯著性，擬合度良好。得到超聲波輔助提取多穗柯棕色素的最佳工藝條件：多穗柯待測樣品與濃度為0.8%的NaOH溶液按照55∶1的液固比混合，于60℃的溫度下超聲提取1.8 h，提取次數2次，在此條件下測得多穗柯棕色素提取液的吸光度值為0.792，與理論預測值的誤差為0.4%，用該數學模型預測超聲波輔助提取多穗柯棕色素可行可靠。采用響應面法優化多穗柯棕色素提取工藝條件對多穗柯棕色素的綜合利用以及多穗柯棕色素的產業化具有理論指導意義。