新鄉市大氣細顆粒物中細菌種群多樣性及分布特征

黃永超,李慧君,安 珍,徐光翠,范 威,單怡凡,姜 靜,張豐泉,李海斌,吳 輝,吳衛東

(新鄉醫學院公共衛生學院，河南省國際聯合實驗室，河南 新鄉 453003)

細顆粒物(particulate matter,PM2.5)極易被人體吸入并進入全身血液循環，對人體健康造成較大危害[1-2]。已有較多研究關注PM2.5化學組分對健康的影響[3-4]。細菌在近地面空氣中普遍存在[5]，且PM2.5中的微生物具有引發組織炎癥并傳播人類、植物和家畜病原菌等危害[6]，也是反映環境空氣質量的重要指標。王步英等[7]分析了北京市冬季重度霾污染期間PM2.5和PM10中細菌群落特征，結果顯示，細菌種屬多樣性較高且檢測到致病菌屬的存在。大氣中細菌菌屬對營養及生長因子的需求比較多樣，這就導致了培養基選擇上的困難[8]，基于培養方法獲得的微生物信息可能會遺漏一些重要的致病菌或過敏源[9]。高通量測序技術相比傳統的培養方法有著巨大的優勢，利用高通量測序分析技術對細菌基因組中高度保守又特異性變化的16S區進行測序分析，能檢測到大量不可培養的菌種，尤其是低豐度菌種，高通量測序技術已成為微生物生態學研究的一個有效的技術工具[10]。本研究以PM2.5中細菌種群為研究對象,采集新鄉市4個季節大氣PM2.5樣品,利用高通量測序術對PM2.5中的細菌種群結構進行檢測分析,討論4個季節大氣PM2.5中細菌種群分布特征和季節變化差異,旨在了解該地區大氣環境的質量狀況,為從微生物角度闡明PM2.5對人體健康的影響提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 儀器TE-6070大流量顆粒物采樣器(美國Tisch公司),高純玻璃纖維濾膜(北京賽福萊博科技有限公司),二氧化硫分析儀、43i氮氧化物分析儀、48i一氧化碳分析儀、49i臭氧分析儀、1405-BEF PM10顆粒物監測儀、1405F-BVF PM2.5顆粒物監測儀、146i-DT3BEAA多元動態校準儀、111-B2R零氣發生器、WS500-umb氣象五參數(丹麥HermoScientific公司)，810H數據采集儀(深圳研祥智能科技),YQTS-711減壓閥(上海減壓閥廠)。

1.2 PM2.5樣品采集采樣地點在新鄉醫學院院系樓樓頂(采樣口距離地面約22 m)。采樣時間選擇春、夏、秋、冬4個季節任意時間,每個季節采樣3 d,春季、夏季、秋季、冬季采樣時間分別為2017年4月、2017年9月、2017年11月、2018年1月。每天采樣24 h(當日10:00至次日10:00)。每天采樣結束后的濾膜置于-20 ℃下保存，每個季節采樣結束后統一提取PM2.5樣品細菌基因組DNA。

1.3 4個季節空氣質量和氣象指標測定分別于取樣結束后記錄由1.1所列儀器自動測定的空氣質量指標(PM2.5、PM10、SO2、CO、NO2、O3)和氣象指標溫度(temperature,T)和相對濕度(relative humidity,RH)，取24 h平均值。

1.4 PM2.5樣品細菌基因組DNA提取和高通量測序采用十六烷基三甲基溴化銨法(cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)對PM2.5中細菌基因組DNA進行提取，質量分數1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度。利用16S V4區特異引物515F(5′-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R (5′-GCCAATGGACTACHVGGGTWTCTAAT-5′)進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增,反應條件為98 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；72 ℃延伸5 min。使用TruSeqTMDNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒對PCR產物進行文庫構建，經過Qubit和實時定量PCR(real-time quantitative PCR，Q-PCR)定量，文庫合格后使用Illumina HiSeq 2500 PE250進行高通量測序，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。

2 結果

2.1 4個季節空氣質量和氣象資料結果見表1。4個季節的PM2.5濃度，冬季最高，其次為春季、秋季和夏季;PM2.5污染在冬季和春季最為嚴重。夏季O3濃度最高，其余依次為春季、冬季和秋季;O3污染在夏季最為嚴重。春季、夏季和秋季的相對濕度差別不大，冬季相對濕度最低。

表1 4個季節空氣質量和氣象資料

指標春季夏季秋季冬季T/℃17.5±0.528.5±3.510.2±4.6-0.1±3.8RH/%58.0±9.052.3±17.157.0±9.044.2±14.4PM2.5/(μg·m-3)83.7±21.550.0±15.980.3±46.786.7±84.1PM10/(μg·m-3)156.0±25.689.0±26.2155.3±67.4128.0±106.2SO2/(μg·m-3)61.7±7.854.3±11.074.7±18.560.0±35.9CO/(μg·m-3)1.9±0.21.0±0.51.3±0.31.6±1.1NO2/(μg·m-3)32.7±4.921.3±11.229.3±6.728.3±24.1O3/(μg·m-3)65.7±8.5176.0±25.723.0±14.740.0±15.7

2.2 4個季節PM2.5樣品稀釋曲線結果見圖1。4個季節PM2.5樣品的稀釋曲線均逐漸趨向平緩，說明測序量能夠真實反映4個季節PM2.5樣品中的細菌群落組成，4個季節PM2.5中細菌豐度依次為春季>冬季>夏季>秋季。

圖1 4個季節PM2.5樣品稀釋曲線

Fig.1 Rarefaction curves of PM2.5samples in four seasons

2.3 4個季節PM2.5中細菌群落組成4個季節大氣PM2.5中共檢測到51個細菌門，相對豐度居前10位的分別為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、藍藻門、酸桿菌門、疣微菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門及浮霉菌門(表2)，其中，前4個細菌門相對豐度均在5.24%以上。

在菌屬水平上,共檢測到941個菌屬,相對豐度居前10位的菌屬分別為未鑒定葉綠體、水棲菌屬、假單胞菌屬、副擬桿菌屬、未鑒定線粒體、大腸埃希菌·志賀菌屬、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、副球菌屬、阿克曼菌屬(表3)。春、夏、秋、冬季節相對豐度較高的菌屬分別為乳桿菌屬、乳桿菌屬、未鑒定線粒體、未鑒定葉綠體。菌屬水平未知菌屬所占比例較高，春、夏、秋、冬4個季節分別為28.90%、42.78%、26.97%、29.49%。

表2 4個季節PM2.5樣品中前10位細菌門類相對豐度

Tab.2 Relative abundance of the top 10 bacterial phyla in PM2.5samples in four seasons

細菌門春季夏季秋季冬季變形菌門37.35%34.23%41.81%28.65%放線菌門24.26%16.91%13.88%9.86%厚壁菌門23.90%17.76%23.79%26.63%擬桿菌門5.24%7.49%12.01%15.84%藍藻門3.44%0.48%2.96%9.49%酸桿菌門1.71%6.90%0.66%1.66%疣微菌門0.47%3.86%0.43%2.46%芽單胞菌門0.82%2.46%0.24%0.85%綠彎菌門0.89%2.29%0.35%0.94%浮霉菌門0.39%1.25%0.22%1.08%

表3 4個季節PM2.5樣品中前10位細菌屬相對豐度

Tab.3 Relative abundance of the top 10 bacterial genera in PM2.5samples in four seasons

細菌屬春季夏季秋季冬季未鑒定葉綠體3.38%0.33%2.90%9.27%水棲菌屬0.02%0.46%4.13%0.02%假單胞菌屬0.49%1.10%2.22%5.30%副擬桿菌屬0.03%0.10%4.00%0.20%未鑒定線粒體1.18%0.22%4.57%1.53%大腸埃希菌·志賀菌屬0.16%0.97%3.41%2.01%雙歧桿菌屬0.05%0.40%3.11%0.99%乳桿菌屬7.01%3.58%2.74%1.29%副球菌屬2.89%0.16%0.73%0.44%阿克曼菌屬0.01%0.25%0.29%2.22%其他84.80%92.43%71.88%76.73%

2.4 4個季節PM2.5樣品Alpha多樣性分析結果見表4。春季和冬季PM2.5樣品細菌群落的Chao1指數和ACE指數高于夏季和秋季，4個季節PM2.5樣品中細菌群落豐度依次為春季>冬季>夏季>秋季,4個季節PM2.5樣品中細胞群落多樣性依次為夏季>春季>冬季>秋季。

表4 4個季節PM2.5樣品細菌群落的Alpha多樣性指數

Tab.4 Alpha diversity index of PM2.5bacterial community in four seasons

季節Chao1指數ACE指數Shannon指數Simpson指數春季2256.7462310.1218.6380.989夏季1624.6571618.5699.1910.996秋季1320.0451330.1727.0670.939冬季2090.0292080.8317.9140.967

2.5 4個季節PM2.5中細菌群落Beta多樣性指數比較結果見圖2。春季、夏季、秋季PM2.5中細菌群落Beta多樣性指數兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)，春季和冬季PM2.5中細菌群落Beta多樣性比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖2 4個季節PM2.5樣品Beta多樣性組間差異箱形圖

Fig.2 Box diagram of differences among groups in Beta diversity of PM2.5samples in four seasons

3 討論

2015年全球疾病負擔報告顯示，顆粒物污染成為排名第7位的危險因素，在中國成為排名第6的危險因素，我國每10萬死亡人群中有163.1人死亡與空氣污染有關[11]。李文靜等[12]探討了2013～2015年北京市大氣PM2.5對醫院兒科門診量的影響，單污染物模型分析顯示，PM2.5對兒科總門診量、兒科呼吸系統疾病門診量和兒科其他疾病門診量的影響均有統計學意義，且以當天的效應最強，PM2.5濃度每升高 10 μg·m-3，上述門診量分別增加0.525%、0.589%、0.393%。多污染物模型分析結果顯示，引入其他污染物后，PM2.5對兒科總門診量和呼吸系統疾病門診量的影響仍有統計學意義，PM2.5濃度每升高 10 μg·m-3，上述門診量分別增加0.570%、0.697%。PM2.5中微生物濃度隨PM2.5濃度增加而相應升高，微生物和過敏原介導的呼吸道疾病也相應增加[6]。春季和冬季是呼吸道疾病的高發季節，且PM2.5的濃度也較高，根據本研究結果，春季和冬季樣品細菌豐度高于夏季和秋季，與文獻[12]報道相一致。

王步英等[7]檢測了2013年北京市冬季連續7 d PM2.5樣品中細菌種群，在門的水平上，放線菌門所占比例最高，達62.34%，其次是厚壁菌門(14.64%)、變形菌門(11.47%)、藍藻門(5.45%)和擬桿菌門(3.46%)。在屬的水平上，主要菌屬均為節桿菌屬，其次為弗蘭克菌屬。本研究中，冬季PM2.5樣品中，在門的水平，相對豐度最高的是變形菌門(28.65%)，其次是厚壁菌門(26.63%)、擬桿菌門(15.84%)、放線菌門(9.86%)和藍藻門(9.49%)。在屬的水平，相對豐度最高的是未鑒定葉綠體，其次是假單胞菌屬。由此可見，不同地域PM2.5中細菌種群差異較大。

本研究中，采樣點是在校園內，每個季節僅采集3個樣品，且環境因子對人體健康的影響有低劑量、長時間、多途徑以及累積聯合作用等特點，不能全面代表新鄉市整體情況，需要增加采樣時點，聯合PM2.5中其他組分，結合門診情況，深入探討PM2.5中細菌對人體健康的影響。