酸敏感型自組裝苯硼酸治療系統的制備及體外抗腫瘤活性

唐 巖，李 淵，鄭翠霞，王 蕾，丁 波

(1.南陽市第一人民醫院普外科，河南 南陽 473000；2.鄭州大學藥學院，河南 鄭州 450001)

多西紫杉醇(docetaxel,DTX)是臨床上常用的化學治療藥物，DTX作為一種小分子藥物，由于半衰期短，缺乏腫瘤靶向性，限制了其在臨床中的應用[1-2]。苯硼酸(phenylboronic acid,PBA)能夠與1,2-或1,3-二羥基化合物(如糖類、兒茶酚等)形成苯硼酸酯鍵[3-5]。唾液酸(sialic acid,SA)是分布在細胞膜表面糖基最末端的單糖，在多種腫瘤細胞表面高表達[6-7]。含有PBA結構的納米粒能夠與腫瘤細胞表面高表達的SA相結合，并通過受體介導進入腫瘤細胞。當納米粒進入細胞后，能夠快速釋放藥物，這對化學治療藥物發揮抗腫瘤作用至關重要[3,8-9]。腫瘤微環境響應性藥物釋放已經被廣泛應用于納米藥物遞送系統，且已達到增強療效、降低毒副作用的目的[10]。苯硼酸酯在中性或堿性環境中相對穩定，在酸性環境中發生裂解，能夠對腫瘤部位的弱酸性環境產生快速響應[11-12]。DTX/苯硼酸酯納米粒(phenylboronic acid-based self-assembly nanoparticles，PNPs)可以通過受體介導，增強其進入細胞的能力，并快速響應腫瘤細胞內的酸性環境，從而達到高效遞送藥物、增強DTX抗腫瘤效果的目的。本研究將DTX裝載于共價自組裝PNPs中，制備DTX/PNPs系統，并探討其體外抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器人肝癌HepG2細胞(中國科學院細胞庫)；DTX(大連美侖生物技術有限公司)，對苯二胺和3、4-二羥基苯甲醛(阿拉丁生化科技股份有限公司)，4-甲?；脚鹚?山東西亞化學工業有限公司)，泊洛沙姆188(德國BASF公司)；WSJB-03恒溫磁力攪拌器(河南中良科學儀器有限公司)，H1850R高速離心機(湖南湘儀科學儀器廠)，AB135-S型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)，Waters e2695 高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Nano-ZS 90型激光粒度分析儀(英國Marvin公司)，Mili-Q超純水器(美國Millipore公司)，實驗所用其他試劑均為分析純；緩沖溶液和樣品溶液配制用水均為超純水。

1.2 DTX/PNPs的制備

1.2.1 B，B′-[1,4-亞苯基雙(亞硝基甲基炔-1,4-亞苯基)]苯硼酸(Im-Ba)的合成合成路線見圖1。稱取50 mg對苯二胺、15 mg 4-甲?；脚鹚嶂糜趫A底燒瓶中，加入20 mL甲醇，得到黃色透明溶液。室溫攪拌，溶液逐漸由澄清變渾濁，12 h后結束反應，12 000×g離心5 min，棄上清液；沉淀用冰甲醇洗滌3次，得到的黃色固體即為Im-Ba，真空干燥備用[13]。

1.2.2 4,4′-[1,4-亞苯基雙(亞甲氧基甲基)]1,2-苯二醇(Im-Ca)的合成合成路線見圖1。稱取150 mg對苯二胺、400 mg 3,4-二羥基苯甲醛溶于 10 mL 無水乙醇中，室溫、氬氣保護、避光條件下攪拌12 h。反應結束后，12 000×g離心5 min，棄上清液；沉淀用預冷無水乙醇洗滌3次，得到的棕色固體即為Im-Ca，真空干燥備用[13]。

圖1 Im-Ba、Im-Ca的合成路線

Fig.1 Synthesis routes of Im-Ca and Im-Ba

1.2.3 DTX/PNPs的制備采用乳化溶劑揮發法制備DTX/PNPs。稱取10 mg Im-Ca和400 mg泊洛沙姆188置于15 mL EP管中，加入10 mL超純水，60 ℃水浴10 min使其溶解，冷卻至室溫，轉移到圓底燒瓶中。稱取10 mg Im-Ba和20 mg DTX置于 15 mL EP管中，加入10 mL甲醇，超聲使其溶解，然后在攪拌過程中滴加到Im-Ca和泊洛沙姆188水溶液中，室溫、避光、敞口攪拌24 h。反應結束后，將反應液在超純水中透析8 h以除去游離的DTX，所用透析袋截留相對分子量為8 000 000～14 000 000。

1.3 DTX/PNPs的質量評價

1.3.1 制劑外觀取1.5 mL DTX/PNPs的水溶液于小玻璃瓶中，拍照觀察其外觀。

1.3.2 形態觀察取200 mg·L-1DTX/PNPs水溶液適量，滴加到銅網超薄碳膜上，自然晾干，用透射電鏡(TEM-1400)觀察其形態特征。

1.3.3 粒徑和電位表征配置200 mg·L-1DTX/PNPs水溶液適量，用Nano-ZS90型激光納米粒度儀測定其粒徑和Zeta電位。

1.3.4 穩定性考察將DTX/PNPs稀釋至200 mg·L-1，室溫保存，每日測量其粒徑及電位，連續測量1周。

1.4 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定DTX含量

1.4.1 色譜條件色譜柱為Inertex C18柱(250.0 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇乙腈(3665，V/V)，檢測波長為230 nm，柱溫為(30±5) ℃，進樣量為20 μL，流速為1.0 mL·min-1，檢測時間為12 min。

1.4.2 標準曲線建立精密稱取DTX對照品10 mg，用甲醇溶解定容至50 mL容量瓶中，得到濃度為200 mg·L-1的DTX儲備液，并依次稀釋成0.1、0.5、2.5、5.0、10.0、50.0 mg·L-1的系列濃度溶液，分別進樣20 μL，以峰面積(A)為縱坐標，濃度(C)為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程A=10 384×C-4 404.9(R2=0.999 8)，線性范圍為0.10～50.00 mg·L-1。

1.4.3 載藥量測定將300 μL DTX/PNPs溶液分散到2.7 mL甲醇溶液中，并將該混懸液在冰浴條件下超聲處理30 min，確保DTX完全溶解于甲醇中，15 000×g離心10 min，按公式計算載藥率。載藥率=荷載的DTX量/(荷載的DTX量+所投PNPs量)×100%。

1.5 體外釋藥分別以pH值為5.0磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、pH值為6.0 PBS、pH值為7.4 PBS作為釋放介質。取2 mL的DTX/PNPs溶液置于透析袋中，再向透析袋中加入 2 mL 透析介質，透析袋兩端用繩子系緊，浸入30 mL釋放介質中，置于搖床上，37 ℃恒溫，轉速為100 r·min-1條件下釋藥。分別在0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36 h時，取釋放介質500 μL，再加入500 μL相應空白釋放介質。按照“1.4.1”項中的色譜條件檢測樣品，然后根據標準曲線計算不同時間點釋放介質中DTX濃度，并按照公式計算DTX的累計釋放百分數，繪制釋放曲線。

1.6 體外抗腫瘤實驗

1.6.1 細胞培養采用人肝癌HepG2細胞[14]為實驗細胞株。將人肝癌HepG2細胞置于含體積分數10%胎牛血清和含1%雙抗(100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)的達爾伯克改良伊格爾培養基，在含體積分數5%CO2、37 ℃飽和濕度的培養箱中培養，隔天換液或傳代處理。

1.6.2 四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法檢測PNPs對細胞增殖的抑制情況取對數生長期HepG2細胞，接種于96孔板中，細胞密度調整為每孔7×103個，繼續培養24 h。當細胞貼滿孔底時，棄去原來的培養基，并加入含3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg·L-1PNPs的完全培養基，每組設置3個復孔。平行做2組，分別培養24、48 h后，加入1 mg·L-1MTT。繼續培養4 h，棄去含MTT的培養基，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，置于搖床中,37 ℃ 100 r·min-1振搖 10 min；于 490 nm 處測量各孔的吸光度值，計算細胞存活率。細胞存活率=實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.6.3 MTT法檢測納米藥物對細胞增殖的抑制情況收集對數生長期HepG2細胞，接種于96孔板中，細胞密度調整為每孔7×103個，每孔加 100 μL 細胞懸液，置于37 ℃ 恒溫培養箱中培養 24 h。將細胞分為空白對照組、DTX組、DTX/PNPs(pH值為6.0)組、DTX/PNPs(pH值為7.4)組。分別使用pH值為6.0、7.4的細胞培養基稀釋DTX/PNPs，使DTX濃度分別為0.135、0.270、0.800、2.500、5.000 mg·L-1。待細胞貼壁后，棄去原來的培養基，分別加入空白培養基、含DTX培養基、含DTX/PNPs(pH值為6.0)培養基和含DTX/PNPs(pH值為7.4)培養基2 mL，繼續培養4 h，棄去含藥培養基，加入等體積的新鮮培養基。每組設置3個復孔，培養48 h，按 “1.6.2”項下方法，使用MTT法檢測其在490 nm處的吸光度值，計算細胞抑制率。細胞抑制率=(1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

1.6.4 流式細胞術檢測納米藥物對細胞周期分布的影響取對數生長期HepG2細胞接種于6孔板中，細胞密度調整為每孔3×105個，置于恒溫培養箱中培養24 h；將細胞分為空白對照組、PNPs組、DTX組、DTX/PNPs組。待細胞貼壁后，棄去原來的培養基，PNPs組、DTX組、DTX/PNPs組、空白對照組分別加入含PNPs(pH值為6.0)、DTX(pH值為6.0)、DTX/PNPs (pH值為6.0)和不含藥的新鮮培養基2 mL，其中DTX濃度為 3 mg·L-1，置于培養箱中培養48 h。用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化收集細胞，預冷的體積分數75%乙醇在4 ℃ 固定細胞24 h。棄去乙醇固定液，PBS洗滌2次，然后加入100 mg·L-1RNA酶作用30 min。棄去RNA酶溶液，用PBS洗滌2次，加入50 mg·L-1碘化丙啶(propidium iodide，PI)500 μL，避光條件下作用30 min 后，使用流式細胞儀進行檢測各組細胞的細胞周期分布情況。

1.6.5 PI染色法檢測納米藥物誘導細胞凋亡情況取對數生長期HepG2細胞接種于6孔板中，細胞密度調整為每孔3×105個，置于恒溫培養箱中培養24 h；將細胞分為空白對照組、PNPs組、DTX組、DTX/PNPs組。待細胞貼壁后，棄去原來的培養基，并分別加入含PNPs(pH值為6.0)、DTX(pH值為6.0)、DTX/PNPs (pH值為6.0)和不含藥的新鮮培養基2 mL，其中DTX濃度為3 mg·L-1，置于培養箱中培養 48 h。收集各組細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液；加入5 μL Binding Buffer和0.5 mL膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素輕輕吹打重懸細胞，室溫避光作用30 min后，加入5 μL PI混勻，室溫避光作用 15 min 后，使用流式細胞儀進行檢測，計算各組細胞的凋亡指數，凋亡指數=(早期凋亡細胞數+晚期凋亡細胞數)/細胞總數 × 100%。

2 結果

2.1 DTX/BNPs納米粒質量評價

2.1.1 DTX/PNPs的制備Im-Ba和Im-Ca的紅外光譜如圖2所示，3 409 cm-1和3 374 cm-1為對苯二胺中伯胺N-H的伸縮振動峰，在合成的Im-Ba和Im-Ca中，叔胺無N-H，故無N-H伸縮振動峰。4-甲酰基苯硼酸在2 844 cm-1和2 749 cm-1出現羰基C-H伸縮振動峰，3、4-二羥基苯甲醛在2 872 cm-1和 2 766 cm-1出現羰基C-H伸縮振動峰；二者在分別形成Im-Ba和Im-Ca后，羰基C-H伸縮振動峰消失。證明成功制備前體化合物Im-Ba和Im-Ca。

A：Im-Ba;B:Im-Ca。

圖2 Im-Ba、Im-Ca的傅里葉紅外光譜圖

Fig.2 Fourier infrared spectroscopy of Im-Ba,Im-Ca

2.1.2 DTX/BNPs的外觀及粒徑電位結果見圖3。DTX/PNPs為球形，且在水溶液中穩定，納米粒平均粒徑為(180.0±1.7) nm，多分散系數為0.18，電位為(-20.0±0.9) mV。

A：DTX/PNPs的透射電鏡圖；B：DTX/PNPs的外觀圖；C：DTX/PNPs的粒徑圖；D：DTX/PNPs的電位圖

圖3 DTX/PNPs的TEM、外觀、粒徑和電位圖

Fig.3 TEM image,appearance,size and zeta of DOX/PNPs

2.1.3 載藥量測定DTX的載藥量為(45.4±2.5)%。

2.1.4 穩定性考察室溫條件下，DTX/PNPs在第1、2、3、5、7天的粒徑分別為(211.6±3.8)、(219.1±2.7)、(218.4±4.1)、(226.5±1.9)、(224.4±3.2) nm；電位分別為 (-21.7±1.1)、(-21.9±1.4)、(-22.0±1.2)、(-21.8±9.9)、(-22.1±1.6)mV。

2.2 DTX/BNPs體外釋藥結果見表1。在pH值為5.0、pH值為6.0、pH值為7.4的PBS溶液中，36 h時DTX累積釋放百分率分別為(80.61±3.09)%、(55.81±3.05)%、(11.88±1.90)%。DTX在pH值為5.0、pH值為6.0的PBS溶液中的累計釋放百分數高于DTX在pH值為7.4的PBS溶液中的累計釋放百分數，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 DTX/PNPs體外抗腫瘤實驗

2.3.1 PNPs、DTX、DTX/PNPS對細胞增殖的抑制作用結果見表2和表3。培養24、48 h后，濃度為3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg·L-1PNPs組的細胞存活率均大于90%。藥物作用48 h后，DTX濃度為0.135、0.270、0.800、2.500、5.000 mg·L-1時，DTX/PNPs(pH值為6.5)組、DTX/PNPs(pH值為7.4)組細胞抑制率高于DTX組，差異有統計學意義(P<0.01)；DTX/PNPs(pH值為6.5)組細胞抑制率高于DTX/PNPs(pH值為7.4)組，差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 不同pH條件下DTX累積釋放百分數比較

時間/hDTX累計釋放百分數/%pH7.4pH6.0pH5.00.253.74±1.5115.46±2.4414.74±3.610.505.64±2.0920.61±2.5029.33±2.001.008.21±2.3029.62±2.1843.18±3.062.0010.61±2.6242.17±2.9057.81±4.324.0012.82±1.8950.10±3.49a75.77±2.64a8.0011.64±2.5052.72±2.95a78.86±3.36a12.0011.54±1.7854.78±3.40a80.99±4.27a24.0011.83±2.4655.00±3.27a79.02±3.11a36.0011.88±1.9055.81±3.05a80.61±3.09a

注：與pH值為7.4條件下比較aP<0.05。

表2 不同濃度PNPs作用后的細胞存活率

時間細胞存活率/%3.125mg·L-16.250mg·L-112.500mg·L-125.000mg·L-150.000mg·L-124h99.51±2.5198.66±2.4497.84±4.6195.67±3.8296.00±5.1148h98.92±3.9098.81±3.0597.98±2.9995.37±4.6195.89±3.72

表3 不同DTX濃度作用48 h空白對照組、DTX組、DTX/PNPs (pH值為6.5)組、DTX/PNPs (pH值為7.4)組細胞抑制率比較

組別細胞抑制率/%0.135mg·L-10.270mg·L-10.800mg·L-12.500mg·L-15.000mg·L-1空白對照組0.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.000.00±0.00DTX組20.01±3.3235.54±2.4642.93±1.1853.59±1.9358.96±3.71DTX/PNPs(pH6.5)組52.44±3.58a64.16±2.65a72.81±2.29a80.73±2.14a89.06±1.52aDTX/PNPs(pH7.4)組39.29±3.97ab50.66±3.25ab57.15±2.92ab63.80±2.11ab73.36±1.67ab

注：與DTX組比較aP<0.001；與DTX/PNPs (pH 7.4)組比較bP<0.01。

2.3.2 各組細胞周期比較結果見表4。PNPs組G0/G1、S和G2/M期細胞所占百分比與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，DTX、DTX/PNPs組G0/G1期細胞所占百分比顯著低于空白對照組，S期細胞所占百分比顯著高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3.3 PNPs、DTX、DTX/PNPs誘導細胞凋亡比較空白對照組、PNPs組、DTX組、DTX/PNPs組細胞凋亡指數分別為(4.6±1.3)%、(4.6±1.7)%、(38.1±2.1)%和(44.2±1.9)%；空白對照組與PNPs組細胞凋亡指數比較差異無統計學意義(P>0.05)。DTX組、DTX/PNPs組細胞凋亡指數高于空白對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 空白對照組、PNPs組、DTX組、DTX/PNPs組細胞周期比較

組別細胞周期時相分布/%G0/G1期S期G2/M期空白對照組66.8±2.330.7±3.52.5±1.2PNPs組63.6±3.123.1±2.813.3±1.8DTX組41.7±1.2a48.7±2.9a9.5±2.3DTX/PNPs組26.3±1.9a59.6±2.3a14.1±4.2

注：與空白對照組比較aP<0.01。

3 討論

癌癥是威脅人類生命健康的重大疾病，發病率和病死率逐年上升。目前臨床上癌癥的治療方法主要有化學治療、放射治療、手術治療等，其中化學治療是臨床上最常用的治療手段或者輔助治療的手段。小分子化學治療藥物DTX由于其選擇性較差，所以毒副作用較強。為了改善化學治療藥物的毒副作用，將納米技術應用于抗腫瘤藥物的遞送，不僅能降低藥物的毒副作用，還能夠有效克服藥物遞送屏障，提高腫瘤治療效果。本研究利用苯硼酸酯能夠響應腫瘤微環境弱酸性的特點，以苯硼酸兒茶酚酯鍵為連接鍵，以泊洛沙姆188為穩定劑，以DTX為化學治療藥物模型，成功構建具有細胞識別作用和腫瘤微環境響應特性的共價自組裝納米粒。本研究所制備的DTX/PNPs pH雙響應行為可描述為：在腫瘤弱酸性的微環境中，納米粒表面的泊洛沙姆層脫落，納米粒結構改變，暴露出能與SA結合的PBA；通過受體介導的細胞內吞，納米粒進入細胞內部，由于腫瘤內部酸性環境更強，酯鍵快速斷裂，納米粒分崩離析，實現酸響應性藥物快速釋放[15-17]。

本研究首先對DTX/PNPs的性質進行了考察。納米粒的形貌及粒徑、電位等參數是評價納米粒質量的重要標準，利用透射電鏡對納米粒的形貌進行了考察，利用動態光散射對DTX/PNPs的粒徑分布和電位大小進行分析，發現DTX/BNPs納米粒分散性好，粒形態均一，而且其粒徑大小符合腫瘤深層滲透的條件。1周內納米粒的電位和粒徑變化結果表明，泊洛沙姆188的存在能夠有效的維持了納米粒的穩定性。體外釋放實驗表明，DTX/PNPs的酸敏感性良好，酸性環境能夠有效地促進苯硼酸酯鍵的斷裂，進而納米粒崩解，實現定位釋藥。

本研究選取人肝癌HepG2細胞為模型[14,18]，對DTX/PNPs的體外抗腫瘤活性進行了考察。PNPs濃度為50 mg·L-1時，培養48 h細胞存活率仍大于90%，說明PNPs安全性高，分析原因為組成PNPs納米粒的單體化合物安全無毒，而且泊洛沙姆188的生物相容性好[15,19]。DTX/PNPs在弱酸性環境中能增強SA介導的細胞內吞，且在腫瘤內部快速釋放藥物[20-21]，DTX、DTX/PNPs作用48 h后對HepG2細胞的生長抑制均表現出一定的劑量依賴性。DTX/PNPs對細胞抑制作用要高于DTX，主要是因為在pH值為6.0的弱酸性環境中，DTX/PNPs表面的泊洛沙姆脫落，PBA暴露，SA介導增強細胞內吞[16-17]。為進一步驗證這個理論，對DTX/PNPs在不同pH環境中對細胞的抑制情況進行了研究，結果顯示，DTX/PNPs在pH值為6.0的環境中對腫瘤的抑制效果強于pH值為7.4的環境中對細胞的抑制效果。利用化學治療方法治療腫瘤的機制之一就是對腫瘤細胞的DNA造成損傷[22-23]。空白對照組細胞主要分布于G0/G1期,與空白對照組相比，PNPs組細胞周期時相分布無明顯變化，說明載體生物相容性好，無明顯毒副作用。DTX和DTX/PNPs明顯阻滯細胞周期于S和G2/M期。并且，與空白對照組比較，DTX/PNPs組G0/G1期細胞所占百分比減少，提示DTX/PNPs阻滯作用更明顯。凋亡實驗結果也表明，相對于空白對照組、DTX組、DTX/PNPs組可誘導更多的細胞發生凋亡。DTX/PNPs能夠有效抑制腫瘤細胞的生長，主要是因為納米粒能夠特異性響應腫瘤酸性環境，定點釋藥，此外，也與脫落的泊洛沙姆188抑制了p-糖蛋白對藥物的外排密切相關[22]，綜上所述，DTX/PNPs納米粒的制備比較簡單，靶向性強，生物相容性好，安全性高，能夠提高藥物的生物利用度，為實現腫瘤高效治療提供了新途徑。