臍帶間充質干細胞對急性卵巢缺血再灌注損傷小鼠卵巢組織中過氧化物歧化酶及白細胞介素-12表達的影響

鄒曉萍，葉豪奕，程 虎，回月彤，商崇智，董化江，王 磊，徐 健

(1.中國人民武裝警察部隊特色醫學中心婦產科,天津 300162；2.中國人民武裝警察部隊后勤學院，天津 300189；3.中國人民武裝警察部隊特色醫學中心神經外科，天津 300161；4.中國醫學科學院北京協和醫學院生物醫學工程研究所，天津 300192)

卵巢扭轉為女性常見急癥，多由于劇烈運動后及腫瘤壓迫、腸扭轉、腸套疊、嵌頓疝時腸系膜靜脈和動脈受壓等所致，如處理不及時可出現卵巢梗死或卵巢破裂，恢復血液供應是最為有效的治療方法[1-2]。發生扭轉的卵巢恢復正常解剖位置后血液供應得到恢復，卵巢組織損傷反而較單純缺血階段更為嚴重，即出現卵巢組織缺血再灌注損傷，其多由免疫微環境紊亂、炎癥反應、氧化應激、自由基增多等因素引起，臨床上尚無特效藥物和效果好的處理手段[3-5]。近年來，部分干細胞技術應用于臨床，取得了較好的治療效果[6-8]。間充質干細胞(matrix stem cells,MSC)在免疫系統疾病及組織再生領域不斷顯示出其優勢，其治療效用的維持依賴于細胞替代及“偽旁觀者效應”2種機制[9]。本研究選用臍帶間充質干細胞(umbilical cord-matrix stem cell,UC-MSC)對卵巢扭轉小鼠進行干預治療,探討其對缺血再灌注損傷卵巢炎癥反應及氧化應激損傷的影響，為卵巢缺血再灌注損傷提供新的治療手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組無特定病原體級C57BL/6NCrl雌性小鼠30只，體質量18～23 g，購自華阜康生物科技股份有限公司(北京)，品系編碼：213。將小鼠隨機分為假手術組、模型組和干細胞組，每組10只。各組小鼠于18.5～21.5 ℃、濕度38.8%～43.5%環境分籠喂養，給予充足的潔凈飲水和食物，每日日光燈照射時間為12 h。

1.2 主要試劑與儀器UltraCULYURETM培養基(美國Lonza公司)，白細胞介素-12(interleukin-12，IL-12)多克隆抗體(美國Sigma公司)，胎牛血清、過氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)多克隆抗體(美國Gibco公司)，CD90、CD73、CD105流式抗體(美國BD公司)，RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)儀(美國MJ Research公司)，Western blotting 電泳儀、Western blotting電轉儀(美國Bio-Rad 公司)，CX23生物顯微鏡(日本Olympus公司)，生物安全柜(蘇州安泰空氣技術有限公司)。

1.3 UC-MSC分離與擴增臍帶來源于本院產婦，均經產婦本人及家屬知情同意,并簽訂相關的醫療文書及臍帶使用知情同意書。將潔凈臍帶去除血液和表皮組織，剝離臍帶內的2條動脈及1條靜脈，剩余組織為華通膠，將華通膠剪切成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，加入培養基，置于37 ℃、含體積分數5%CO2的培養箱進行培養，第7天可見有UC-MSC自華通膠內爬出，第10天細胞長滿培養瓶底部，按照1傳5的比例進行傳代擴增，然后按照1傳2的比例進行擴增，選取第3代細胞用于本研究。質量控制標準為CD73、CD90、CD105陽性細胞數>95%，CD34陽性細胞數<3%，細胞活力 ≥95%，病原菌排查未檢出細菌。

1.4 小鼠卵巢缺血再灌注模型制備及各組干預措施各組小鼠仰臥位固定于手術操作臺上，給予100 g·L-1水合氯醛(0.004 mL·g-1)麻醉，切開下腹部皮膚、肌肉，暴露卵巢組織；其中假手術組小鼠僅在卵巢動脈下穿線，不阻斷卵巢動脈的血流供應；模型組與干細胞組小鼠阻斷卵巢動脈血液供應30 min，而后剪斷卵巢動脈的結扎線，恢復卵巢血液供應。干細胞組小鼠于恢復卵巢血液供應后24 h后經尾靜脈注射1.0×106個UC-MSC，假手術組、模型組小鼠均于同時間點尾靜脈注射相同體積的生理鹽水；各組小鼠均于尾靜脈注射72 h后采用安樂死方法處死，取手術側卵巢組織標本待檢。

1.5 實時定量PCR檢測各組小鼠卵巢組織中IL-12和SOD mRNA表達應用TRIzol試劑提取各組小鼠手術側卵巢組織總RNA，根據試劑盒說明反轉錄合成cDNA。IL-12引物序列：上游引物序列為5′-TTTCTAGATGCTGGCCAATACA-3′,下游引物序列為5′-ATCTCGGTGGACCAAATTCC-3′。SOD引物序列：上游引物序列為5′-AGCGTGACTTTGGGTCTTT-3′,下游引物序列為5′-GCGACCTTGCTCCTTATTG-3′。β-actin引物序列：上游引物序列為5′-GTGTGGATTGGTGGCTCTATC-3′,下游引物序列為5′-CAGTCCGCCTAGAAGCATTT-3′。反應條件：94 ℃預變性 3 min，變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，共29個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用快速凝膠成像系統拍攝電泳圖譜條帶，利用圖像分析軟件分析條帶灰度值。

1.6 Western blot法檢測各組小鼠卵巢組織中IL-12和SOD蛋白表達取各組小鼠手術側卵巢組織100 mg，加入1 mL蛋白磷酸酶細胞裂解液(4 g·L-1)，液氮研磨，4 ℃、12 000 r·min-1、離心半徑15 cm條件下離心20 min。取總蛋白樣本 50 μg，分離膠進線分離總蛋白，將蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯膜，封閉5 h，加入一抗(IL-12多克隆抗體或SOD多克隆抗體)，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，曝光、掃描底片，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參，對各組目的基因條帶的灰度值進行分析，計算其相對表達量，灰度值越高，表示蛋白表達量越大。

2 結果

2.1 3組小鼠卵巢組織中IL-12及SOD mRNA表達比較結果見表1。3組小鼠卵巢組織中IL-12、SOD mRNA表達比較差異均有統計學意義(F=3.761、3.134，P<0.01)。模型組小鼠卵巢組織中IL-12 mRNA表達顯著高于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)；干細胞組小鼠卵巢組織中IL-12 mRNA表達顯著低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；干細胞組與假手術組小鼠卵巢組織中IL-12 mRNA比較差異無統計學意義(P>0.05)。模型組和干細胞組小鼠卵巢組織中SOD mRNA表達高于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)；干細胞組小鼠卵巢組織中SOD mRNA表達水平高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 3組小鼠卵巢組織中IL-12及SOD mRNA表達比較

組別nIL-12mRNASODmRNA假手術組100.194±0.0410.258±0.109模型組100.568±0.186a0.290±0.131a干細胞組100.309±0.163b0.741±0.228abF3.7613.134P<0.01<0.01

注：與假手術組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。

2.2 3組小鼠卵巢組織中IL-12及SOD蛋白表達比較結果見表2、圖1。3組小鼠卵巢組織中IL-12、SOD蛋白表達比較差異均有統計學意義(F=2.520、4.458，P<0.01)。模型組小鼠卵巢組織中IL-12蛋白表達顯著高于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)；干細胞組小鼠卵巢組織中IL-12蛋白表達顯著低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；干細胞組與假手術組小鼠卵巢組織中IL-12蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。模型組和干細胞組小鼠卵巢組織中SOD蛋白表達高于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)；干細胞組小鼠卵巢組織中SOD蛋白表達高于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 3組小鼠卵巢組織中IL-12及SOD蛋白表達比較

組別nIL-12蛋白SOD蛋白假手術組100.231±0.1010.194±0.089模型組100.649±0.214a0.224±0.091a干細胞組100.254±0.070b0.579±0.243abF2.5204.458P<0.01<0.01

注：與假手術組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。

注：A：假手術組；B：模型組；C：干細胞組。

圖1 3組小鼠卵巢組織中IL-12及SOD蛋白表達(Western blot)

Fig.1 Expression of IL-12 and SOD protein in ovarian tissues of mice in the three groups(Western blot)

3 討論

卵巢扭轉是女性常見病，可見于劇烈運動后及血管外腫瘤壓迫、腸扭轉、腸套疊、嵌頓疝時腸系膜靜脈和動脈受壓等情況下，如果處理不當，輕者可出現輸卵管粘連、阻塞，重者可出現卵巢梗死、破裂等[1-3]。恢復血流灌注是該病的有效治療方法，但在扭轉的卵巢恢復正常解剖部位及血液供應后，往往卵巢組織損傷較缺血階段更為嚴重，相繼出現各類并發癥，臨床處理棘手，治療效果差，因此，對卵巢扭轉的處理仍需高度重視[3-5]。

MSC是一類具有體外擴增和多向分化潛能的細胞，可分化為神經元、膠質細胞、心肌細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等[6-8]。研究表明，不同組織來源的MSC及其分泌的細胞因子和外泌體可通過改善卵巢組織微環境、免疫調節而促進卵泡發育，恢復卵巢早衰患者的卵巢功能及生育能力[9]。另有研究證實，UC-MSC及骨髓來源的MSC外泌體可通過調節血清激素水平，降低順鉑對卵巢的損傷，修復卵巢功能[10]。在體外培養的UC-MSC可通過旁分泌或自分泌方式產生多種具有生物活性的因子，如缺血誘導的因子、神經源性生長因子、血管生成素、血管內皮生長因子、基質起源的因子、肝細胞生長因子、胰島素樣生長因子、纖維母細胞生長因子等，對損傷組織的恢復及組織重建具有促進作用[8]。UC-MSC在抑制炎癥反應和免疫調節過程中具有雙重作用，可通過抑制炎癥進程及發揮免疫調節作用而抑制炎癥反應，維持機體免疫微環境穩定[8,11-12]。本課題組前期研究亦發現，使用UC-MSC培養上清液提取物進行治療亦可起到與細胞治療類似的效果，UC-MSC的治療作用機制涵蓋細胞替代作用及 “無細胞”的“偽旁觀者效應”2種途徑[9,13-14]。

IL-12作為促進炎癥反應的重要炎性因子，在炎癥進程中的作用不可輕視，阻斷IL-12的炎癥反應通路對有效控制炎癥有重要意義。缺氧或局部缺血情況下可引發活性氧(reactive oxygen specie，ROS)大量產生，過多的ROS可直接損傷細胞膜、DNA和蛋白質,導致細胞功能的改變和喪失，并抑制細胞增殖，誘導凋亡[13-17]。樊志剛等[13]研究證實，胚胎干細胞可以通過抑制氧化應激反應進程而逆轉糖尿病腎病的發生、發展。袁春菊[17]研究顯示，依那普利對梗死心肌微環境的調節有助于提高UC-MSC的療效，其主要作用機制為抑制炎癥級聯放大及降低氧化應激反應，而這二者對損傷心室的重構具有促進作用。基于上述研究,本課題組推測UC-MSC可通過抑制炎癥反應及降低氧化應激反應而保護受損卵巢組織。臍帶作為醫療廢品,重新再利用可實現“變廢為寶”；同時，UC-MSC體外擴增及分化能力強,是良好的“種子細胞”[6,8,15]?；谏鲜鲈?，本研究選用無倫理學爭議的UC-MSC，觀察其對炎癥因子IL-12及氧化應激損傷的代表性酶SOD的影響，以探討其對卵巢扭轉小鼠的治療效果。

本研究結果顯示，模型組小鼠卵巢組織中IL-12 mRNA、IL-12蛋白表達顯著高于假手術組；而經過UC-MSC干預后，干細胞組小鼠卵巢組織中IL-12 mRNA、IL-12蛋白表達顯著低于模型組，且干細胞組與假手術組小鼠卵巢組織中IL-12 mRNA、IL-12蛋白表達比較差異無統計學意義；提示UC-MSC干預可有效下調卵巢缺血再灌注小鼠卵巢組織中IL-12表達，因此，UC-MSC可作為卵巢扭轉后控制炎癥反應的重要干預手段之一。另外，本研究發現，模型組和干細胞組小鼠卵巢組織中SOD mRNA、SOD蛋白表達顯著高于假手術組，且干細胞組小鼠卵巢組織中SOD mRNA、SOD蛋白表達高于模型組；提示卵巢缺血再灌注損傷小鼠卵巢組織中SOD表達有所上調，UC-MSC干預可進一步上調SOD表達，從而有效減輕小鼠缺血再灌注損傷卵巢組織的氧化應激反應和氧化損傷。

綜上所述，UC-MSC移植可降低小鼠缺血再灌注損傷卵巢組織中IL-12表達，提高SOD表達，抑制炎癥反應，改善氧化應激損傷，有益于受損卵巢功能的恢復。本研究為卵巢缺血再灌注損傷的干細胞治療提供了理論基礎和依據，但不足之處在于尚不能明確其分子機制及UC-MSC的作用機制，有待后續進一步研究。