GaAlAs激光對牙髓中Shh蛋白表達的影響

呂學超

哈爾濱醫科大學附屬口腔醫院兒童口腔科，黑龍江哈爾濱 150001

當牙髓牙本質復合體受到損傷時，原發性牙本質連同下層牙髓組織表現出退行性病變。隨著新分化的成牙本質細胞樣細胞取代壞死牙本質細胞有助于產生新的礦化組織。在此過程中牙髓干細胞發揮了作用，然而其分子機制尚不明確。鎵鋁砷（GaAlAs）半導體激光可以用來加速牙髓牙本質復合體的礦化。有報道在直接蓋髓術中應用GaAlAs半導體激光輔助治療暴露牙髓組織比常規直接蓋髓成功率高[1]。

Shh蛋白最早在果蠅中發現，這類分泌性蛋白，能夠自身發生水解，研究發現，Shh通路在許多哺乳動物胚胎發育中起著關鍵作用，在干細胞增殖分化、腫瘤發生、神經干產生、牙胚發育和骨骼生長發育等許多生物學行為中起著調節作用[2]。Shh基因僅有1種類型,哺乳動物包括3種同源的類別:分別是Shh、Dhh、Ihh。這3種基因序列體現出高度同源的特征，Dhh能夠參與生殖細胞的產生及發育；Ihh對軟骨發育有影響作用；而在Hedgehog家族中表達最多的為Shh，發揮主要的信號傳導功能[3]。研究發現，Shh能夠參與細胞在肢體、神經管及體節中的分化建立，對神經管D-V的發育模式、胚胎早期的不對稱發育模式、肢體A-P的發育模式以及體節形成模式均發揮調節作用，還可參與形成某些器官組織的形態構成，如腦、肺臟、眼、脊索、牙齒、毛發及四肢等，還與腫瘤的產生密切相關。通過Shh基因敲除動物的腦、肢體、顱面部及脊索的畸形現象十分突出。因為果蠅中的Hedgehog僅一種，研究具有便利性,因此常把果蠅作為研究對象。雖然說脊椎動物中的形式更多，但研究已證實果蠅的Hedgehog信通路能夠保留在脊椎動物體內，因此提示其功能具有某些相似之處[4]。

Shh途徑包括 Shh、CI/GLI二聚體、SMO。Shh作為一種激活劑，可以與特定的細胞表面受體SMO和修補后的跨膜蛋白連接，起到信號轉導作用。SMO是Shh通路的關鍵激活劑，可以與Shh連接產生復合物[5]。一般來說，Patched抑制SMO的活性。當 Shh與Patched結合時，Patched失去了對SMO的抑制作用。同時，Patched激活轉錄因子Ci/Gli二聚體的活性，將激活的Ci/Gli二聚體轉移到細胞核，調節下游基因的表達，激活Shh信號通路。其中Shh信號通路調控的下游基因可能包括:Ptc、WNT、BMP2、Msx 等[6]。該實驗（2017年2月—2018年2月）旨在評估GaAlAs激光對牙髓中Shh蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 標本制備及分組

采用因牙周病拔除的健康第一磨牙（口腔門診獲得）用脈沖810 nm的GaAlAs半導體激光對近中面進行照射180 s，輸出功率為1.5 W。在激光照射期間，激光纖維的尖端保持接觸牙面，非照射牙齒作為對照組，分別在照射后的3、7和11 d進行免疫組織化學染色。

1.2 實驗步驟

1.2.1 標本的固定和包埋①將準備完畢標本裝入脫水試劑盒并放入沖水池子4 h。②將標本由按說明書梯度脫水。③二甲苯透明:從100%乙醇溶液中取出樣品，干燥，然后放入二甲苯溶液I中。用二甲苯代替無水乙醇約50 min。樣品在二甲苯中放置約2 h。④標本的浸蠟:將已完成的實驗樣品分別放入石蠟中浸潤各兩個鐘頭。⑤包埋:將已經溶解的石蠟倒入包埋器中，并將浸好的組織塊切面朝下包埋。

1.2.2 切片 用切片機連續切片石蠟牙。獲得厚度為5 μm的切片并固定在顯微鏡的載玻片上。

1.2.3 標本的嗜伊紅蘇木素(hematoxylineosinstainHE)染色 每個標本的一個載玻片均用蘇木精-伊紅染色，經過綜合性組織學分析評定整個冠髓和根髓情況。

1.2.4 免疫組織化學染色 采用SABC法SHH蛋白免疫組化試劑盒作為武漢博斯特公司的產品。PBS作為空白對照而不是第一個抗體。主要步驟為：常規脫蠟和水合；用3%過氧化氫去除內源過氧化物酶；阻斷正常血清；過夜用1抗體在4℃；加入生物素化2H，ABC復合體2 h，DAB染色；蘇木精再染色，透明性和密封性。

1.3 圖像分析和統計分析

采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖像分析系統。利用圖像分析軟件，從實驗組每個陽性染色部位隨機選取9個視場，測定其平均光密度（IOD）。測量并計算了對照組相應部位9個視場的平均光密度（IOD）。分別對各組光密度值進行t檢驗。

2 結果

光密度值結果見表1，免疫組織化學染色結果見圖1~4。

表1 牙髓Shh蛋白光密度值的統計結果（±s）

表1 牙髓Shh蛋白光密度值的統計結果（±s）

注：各組之間均差異有統計學意義（P＜0.05）。

指標 3 d 3 d 11 d Shh 121.611±8.232 1 121.998±6.512 3 623.545±1.321

圖1 HSP70在對照組中表達。（×200）

圖2 Shh在照射3 d年輕恒牙牙髓中表達。（×200）

圖3 Shh在照射7 d年輕恒牙牙髓中表達。（×200）

圖4 Shh在照射11 d年輕恒牙牙髓中表達。（×200）

3 討論

GaAlAs半導體激光是一種非磨料激光器。它可以用來加速牙本質/牙髓復合體的礦化。GaAlAs半導體激光輔助治療因齲暴露的牙髓組織報告顯示明顯比常規直接蓋髓術成功率高，表明GaAlAs激光作用源于它的去污和止血能力[7]。

Shh能夠參與細胞在肢體、神經管及體節中的分化建立，對神經管D-V的發育模式、胚胎早期的不對稱發育模式、肢體A-P的發育模式以及體節形成模式均發揮調節作用，還可參與形成某些器官組織的形態構成，如腦、肺臟、眼、脊索、牙齒、毛發及四肢等，還與腫瘤的產生密切相關。通過Shh基因敲除動物的腦、肢體、顱面部及脊索的畸形現象十分突出[8]。Shh蛋白是Shh家族的重要成員之一。分子量為70 kd。它在牙髓細胞的耐熱性、分子保護和信號轉導中起著重要作用。結果表明，在一定程度的預熱刺激下，SHH-hsp70的表達增加，可以恢復牙髓細胞間的通訊，增強堿性磷酸酶的活性。這些反應表明SHH是一種細胞。保護因素起著重要作用[9]。

在該研究中，采用了Shh作為成牙本質樣細胞的標記物，因為有報道它能直接反應這些細胞在受到如備洞等治療后的變化[10]，在激光照射后第3天，少量新生修復牙本質樣礦化組織出現，觀察到存在Shh陽性的成牙本質細胞樣細胞。在第7天，出現了大量的HSP70陽性的成牙本質細胞樣細胞，修復性牙本質樣牙本質層變厚，7 d 達到高峰（1 121.998±6.512 3）。 在第11天時，一些細胞內含物表達Shh，而另一些則沒有，修復性牙本質樣牙本質層的厚度并沒有明顯的變化，11 d 逐漸消退（623.545±1.321）。

在牙體治療中，拋開適應癥的選擇、牙髓的狀態等原因直接蓋髓術的失敗率仍然往往非常的高，應用GaAlAs半導體激光輔助治療牙體組織疾病不失為一種理想的治療方法。