HPLC法測定茶葉中的6種合成著色劑

鄧六愛，張念英，郭 冰，禚歡歡，楊曉敏

（日照市食品藥品檢驗檢測中心，山東日照 276800）

0 引言

茶是一種社會公認的健康飲品。在茶葉中禁止使用合成著色劑，但仍有許多不法生產商在經濟利益的驅使下，通過添加合成著色劑改變茶葉及茶湯色澤，以次充好，以陳茶冒充新茶。合成著色劑主要是通過化學合成的方法制得的有機色素[1]。因色彩鮮艷、著色力強、穩定性好、生產成本低等特點受到食品加工業的青睞，但其不僅不能向人體提供所需營養，并且具有慢性毒性和強致癌性，危害人體健康[2]。我國GB 2760—2014食品安全國家標準 食品添加劑使用標準[3]規定了食品中允許使用的合成著色劑的種類、使用范圍、最大使用量。

目前合成著色劑的檢測方法主要有分光光度法、毛細管電泳法、薄層色譜法（TLC）、極譜法、高效液相色譜法[4-6]、高效液相色譜串聯質譜法[7-8]等。目前對茶葉中合成著色劑的檢測參照GB 5009.35—2016[9]食品安全國家標準食品中合成著色劑的測定進行，但此方法樣品前處理基質不包括茶葉，沒有針對性，在前處理和目標組分定量方面還存在一定問題，無法滿足實際檢測需要。該方法對標準中前處理方法進行了改進，建立了一種同時測定茶葉中6種合成著色劑的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司產品；3-18KS型高速冷凍離心機，德國SIGMA公司產品；EVAP-45型水浴氮氣吹干儀，美國Organomation公司產品；Pressure+48型固相萃取真空裝置 （Biotage）；R-300型旋轉蒸發儀，瑞士BUCHI公司產品。

1.1.2 試劑

（1）標準品。檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍（0.500 mg/mL），中國計量科學研究院提供；新紅（100 mg/L），農業部環境保護科研監測所提供。

（2） 試劑。甲醇（色譜純，CNW）；乙腈（色譜純，CNW）；甲酸（色譜純，CNW）；乙酸乙酯（色譜純，CNW）；乙酸銨（色譜純，CNW）；正己烷（色譜純，CNW）；其他試劑為分析純；所有試驗用水為一級水。

1.2 試驗條件

色譜柱：C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，柱溫30℃，檢測波長范圍：二極管陣列檢測器波長范圍400～800 nm，或紫外檢測器檢測波長254 nm。

流動相：梯度洗脫；20 mmol/L乙酸銨溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脫程序：0 min，A為95%，B為5%；1 min，A為95%，B為5%；8 min，A為65%，B為35%；10 min，A為20%，B為80%；16 min，A為20%，B為80%；18 min，A為85%，B為15%；20 min，A為95%，B為5%。

1.3 試驗方法

茶葉樣品經粉碎后備用。準確稱取2 g（精確到0.001 g） 試樣于50 mL離心管中，加入20 mL氨水-70%甲醇水（1∶99），渦旋混合2 min，超聲提取10 min，以轉速6 500 r/min離心5 min，上清液移入旋蒸瓶中。殘渣加入10 mL氨水-70%甲醇水（1∶99）再提取1次，合并2次上清液。將上清液在40℃水浴條件下，減壓濃縮至約15 mL，加入3 mL甲酸混勻，制成待凈化液。

將待凈化液移入處理好的固相萃取柱中，待樣液完全流出后，加入5 mL甲醇進行淋洗，棄去全部流出液；加入質量分數15%的氨水甲醇溶液5 mL進行洗脫，收集洗脫液。將洗脫液在50℃下氮吹濃縮至近干，用 1.0 mL流動相溶解殘渣，過0.45 μm濾膜，置于高效液相色譜儀測定。

1.3.1 標準曲線的制作

量取適量的檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍標準品，配制成各含有1.00，2.00，5.00，10.0，20.0，50.0，100.0 μg/mL 的混合標準溶液，置于高效液相色譜儀進行分析，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.2 樣品前處理條件優化

分別對樣品的提取溶液、固相萃取柱、淋洗液、洗脫液進行優化，以樣品的加標回收率檢測結果進行比較。

1.3.3 準確性和重復性

以市售茶葉為空白基質，加入混合標準溶液1.5，3.0，15.0 mg/kg選擇優化后的前處理條件進行操作，計算回收率和精密度。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法優化[10-13]

2.1.1 提取方法的選擇

對于合成著色劑檢測，最常用提取方式為聚酰胺吸附法，方法步驟繁瑣、耗時長，容易造成吸附不完全，特別在用于茶葉提取時，合成著色劑無法完全吸附，還會造成其他雜質過度富集，造成樣品上機干擾大、回收率低。因此，試驗溶劑提取后，采用固相萃取柱凈化進行樣品前處理。

2.1.2 SPE柱選擇

茶葉的基質復雜，要同時分析多種合成著色劑組分，僅靠液液分配很難除去干擾物質。且茶葉提取后的溶液體積較大，含有雜質較多，需進行凈化和濃縮富集。因此，選用固相萃取柱對提取液進一步凈化，除去與合成著色劑性質相似的干擾物。

用于合成著色劑檢測的SPE凈化柱主要有氧化鋁凈化柱，C18，HLB，MAX，WAX凈化。試驗選取Proelut PWA-2（混合型弱陰離子）、聚酰胺粉、HLB（N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯親水親脂平衡性填料，通用型凈化柱）、PWAX（混合型弱陰離子）等幾種不同填料的固相萃取柱，在試樣中添加國標2倍定量限水平3.0 mg/kg的標準物質，進行3次平行試驗，通過平均回收率比較幾種固相萃取柱的凈化效果，結果表明，Proelut PWA-2柱進行凈化效果最好。

不同固相萃取凈化回收率結果見表1。

表1 不同固相萃取凈化回收率結果

2.1.3 提取溶劑的選擇

一個合適提取劑需要使基質干擾最小并且能有效提取目標物，同時不帶來新的污染。參考相關文獻[10-13]后，分別選擇乙醇-乙腈-水-氨水、乙腈 -水 （2∶1）、氨水 -70%甲醇水 （1∶99）、乙醇-水-10%氨水（7∶2∶1） 作為提取溶劑進行研究比較，考查在試樣中添加含量均為3.0 mg/kg的標準物質的茶葉樣品，進行平行3次試驗，通過平均回收率結果比較幾種提取溶劑的提取效果。

試驗表明，乙醇-乙腈-水-氨水、乙腈-水（2∶1）、氨水-70%甲醇水（1∶99） 均能提取出茶葉中的合成著色劑。其中，氨水-70%甲醇水提取效果比乙醇-乙腈-水-氨水、乙腈-水（2∶1） 提取溶劑好，并且有機溶劑用量少，回收率高、雜質少、無干擾峰。因此，試驗采用氨水-70%甲醇水（1∶99） 作為提取溶劑。

不同提取溶劑回收率結果見表2。

表2 不同提取溶劑回收率結果

2.1.4 淋洗液選擇

淋洗液的主要作用是將吸附在固相萃取柱上雜質洗掉。參考相關文獻[14-15]，試驗選取甲醇、2%甲酸水、甲醇-甲酸-水作為淋洗液。結果表明，采用添加甲酸的淋洗液，目標物亮藍回收率低。因此只采用甲醇淋洗，既能洗滌去較多雜質且保證不會使目標組分被洗掉，洗滌效果好、回收率高。

不同淋洗液回收率效果見圖1。

圖1 不同淋洗液回收率效果

2.1.5 洗脫液選擇

洗脫液目前國家標準中均采用氨水甲醇溶液，對不同質量分數的溶液洗脫效果進行比較。選取5%氨水甲醇、10%氨水甲醇、15%氨水甲醇、20%氨水甲醇進行洗脫，試驗表明，當氨水質量分數偏低時，幾種著色劑洗脫均不太完全，回收率偏低。氨水質量分數提高到20%時回收率相差不大。采用15%氨水甲醇即能夠快速且完全將固相萃取柱中合成著色劑洗脫下來，達到良好回收。故選擇15%氨水甲醇作為洗脫液。

2.2 工作曲線、線性范圍及檢出限的確認

試驗配制質量濃度為1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00，100.00 μg/mL的6種合成著色劑混合標準工作溶液，在選定色譜條件下進樣，以標準工作液質量濃度為橫坐標、色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到6種合成著色劑的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限、定量限。結果表明，6種合成著色劑在1.00～100.00 μg/mL質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數為0.999 4～0.999 8。

采用空白基質中添加目標組分，采用優化后方法進行前處理后上機，用信噪比法確定方法檢出限（LOD） 和定量限（LOQ），6種目標組分的LOD和LOQ 分別為 0.02～0.08，0.07～0.25 mg/kg。

6種著色劑的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限（LOD）、定量限（LOQ） 見表3。

表3 6種著色劑的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限（LOD）、定量限（LOQ）

2.3 準確度和重復性

選用不添加目標化合物的茶葉作為空白基質做加標回收和精密度試驗，樣品質量濃度為1.5，3.0，15 mg/kg 3個標準，按該方法進行前處理和測定，每種質量濃度平行測定6次，6種著色劑加標回收率在71.3%～85.3%，相對標準偏差均小于5%，方法的回收率和精密度滿足檢測要求。

6種合成著色劑的加標回收率及精密度（n=6）見表4。

表4 6種合成著色劑的加標回收率及精密度（n=6）

3 結論

該方法與GB 5009.35—2016食品安全國家標準食品中合成著色劑的測定相比，對樣品的前處理方法進行了改進，建立了茶葉中6種合成著色劑的高效液相色譜檢測方法，該方法準確度高、重現性好，線性關系、精密度和準確度均獲得滿意的結果，能更好地滿足茶葉中合成著色劑的檢測，具有較高的實用價值。