大薊止血片HPLC 指紋圖譜研究

沈丹萍， 詹常森， 姜 鵬

（上海和黃藥業(yè)有限公司，上海中藥固體制劑創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心，上海201401）

大薊止血片由大薊和干姜2 味藥材組成，主要功效為涼血、止血，臨床應(yīng)用于婦女功能性子宮出血、子宮復(fù)舊不全等。處方大薊4 880 g、干姜120 g，大薊水提醇沉濃縮，干姜醇提濃縮， 兩者混合干燥， 加輔料壓制成1 000片。

大薊，為菊科植物薊Cirsium japonicum Fisch.ex DC.的干燥地上部分，有涼血止血、散瘀解毒消癰之功效［1］。大薊因抗出血被廣泛應(yīng)用于外傷性出血、高血壓和炎癥的治療［2］。大薊止血的主要藥效成分為黃酮類［3］，其中柳穿魚葉苷和蒙花苷促凝血、止血作用被較多報(bào)道［4-5］。干姜，為姜科植物姜Zingiber offcinale Rosc.的干燥根莖，有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲之功效，常用于治療脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、肢冷脈微、寒飲喘咳［1］。干姜主要的有效成分為姜辣素［6-8］。

大薊止血片現(xiàn)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)采用中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)（WS3-B-2468-97-1），標(biāo)準(zhǔn)中質(zhì)量控制只有針對(duì)大薊的薄層鑒別。為了更加全面的控制大薊止血片質(zhì)量，以保障臨床用藥安全性，需進(jìn)一步建立大薊止血片的質(zhì)量控制方法。

文獻(xiàn)已有大薊與干姜的指紋圖譜、含有量測(cè)定和化學(xué)成分分析方法的相關(guān)報(bào)道［1，9-14］，在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合大薊和干姜的主要藥效物質(zhì)，建立了大薊止血片指紋圖譜，較為全面控制大薊和干姜2 味藥材，同時(shí)解決了干姜量少檢測(cè)難問題，以期為進(jìn)一步嚴(yán)格藥材和成品質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器與試劑 Agilent 1100（配有DAD 檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司）；AL204 電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。乙腈、磷酸（色譜純，美國(guó)Tedia 公司）；Milli-Q純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；其余所用試劑均為分析純。柳 穿 魚 葉 苷 對(duì) 照 品 （111728-201502）、 蘆 丁 對(duì) 照 品（100080-201409），均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；蒙花苷對(duì) 照 品 （I-009-140730）、 6-姜 辣 素 對(duì) 照 品 （J-019-140703），均購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；8-姜酚對(duì)照品（141015）、10-姜酚對(duì)照品（141127），均購自上海古朵生物科技有限公司。

1.2 樣品 本實(shí)驗(yàn)收集了10 批大薊止血片（0.4 g／片，36 片／瓶）， 批 號(hào) 分 別 為 150522、 150527、 150610、150703、 150707、 150709、 150805、 150807、 150825、150827。以上樣品均由上海和黃藥業(yè)有限公司提供。大薊藥材購自江西樟樹天齊中藥飲片有限公司；干姜藥材購自上海封浜中藥飲片有限公司。

1.3 陰性樣品 缺大薊陰性樣品，取干姜36 g，精密稱定，按生產(chǎn)工藝要求提取濃縮干燥，加一定比例的輔料使?jié)M足大薊止血片要求質(zhì)量。缺干姜陰性樣品，取大薊1 464 g，精密稱定，按生產(chǎn)工藝要求提取濃縮干燥，加一定比例的輔料使?jié)M足大薊止血片要求質(zhì)量。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Atlantis T3色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫，程序見表1；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)0～65 min（330 nm）、65～125 min（240 nm）；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 分別取柳穿魚葉苷、蘆丁和蒙花苷對(duì)照品約10 mg，6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚對(duì)照品約20 mg，精密稱定，用90%乙醇溶于25 mL 量瓶中，定容，作為貯備液置4 ℃冰箱避光保存。分別取對(duì)照品貯備液適量稀釋，制成混合對(duì)照品溶液，柳穿魚葉苷、蘆丁和蒙花苷質(zhì)量濃度均為50 μg／mL，6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚質(zhì)量濃度均為100 μg／mL。

2.2.2 供試品溶液制備 取大薊止血片粉末20 g，放入50 mL 離心管中，精密稱定，加入10%乙醇30 mL，超聲30 min，3 000 r／min，離心20 min，去上清，處理2 次；殘?jiān)尤?0%乙醇30 mL，超聲30 min，3 000 r／min，離心20 min，去上清， 處理2 次； 殘?jiān)^續(xù)加入無水乙醇30 mL，超聲30 min，3 000 r／min，離心20 min，取上清，處理2 次，合并2 次無水乙醇提取液的上清，蒸干，用90%乙醇定容至5 mL，用0.22 μm 微孔濾膜過濾。

表1 梯度洗脫程序

2.2.3 陰性樣品溶液制備 取陰性樣品粉末各20 g，精密稱定，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備陰性供試品溶液。

2.2.4 藥材溶液制備 分別取大薊、干姜粉末各0.5 g，精密稱定，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備藥材供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取150522 樣品1 份，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6 次，以9 號(hào)峰（柳穿魚葉苷） 為參照峰，結(jié)果21 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.3%，相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取150522 樣品6 份，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下，以9 號(hào)峰（柳穿魚葉苷） 為參照峰，結(jié)果21 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.2%，相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取150522 樣品1 份，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下，分別于0、4、8、12、16、24 h 測(cè)定，以9 號(hào)峰（柳穿魚葉苷）為參照峰，結(jié)果21 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.3%，相對(duì)峰面積RSD 均小于3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 HPLC 指紋圖譜建立

2.4.1 共有峰標(biāo)定 將10 批大薊止血片色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2009 版），以S1 為參照?qǐng)D譜，平均數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜見圖1，疊加圖譜見圖2。結(jié)果，共標(biāo)定出21 個(gè)共有峰，以9 號(hào)峰為參照峰（S），計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見表2。不同樣品相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均小于0.3%；相對(duì)峰面積RSD在4%～25%之間。

表2 10 批樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積

圖1 樣品對(duì)照指紋圖譜

圖2 10 批樣品HPLC 指紋圖譜

2.4.2 相似度分析 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2009 版），對(duì)10 批樣品的指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度結(jié)果見表3。由表可知，10 批樣品相似度在0.95 以上，表明該指紋圖譜具有代表性。

表3 10 樣品相似度

2.5 共有峰來源分析 大薊止血片只有2 味藥組成，通過大薊止血片樣品、缺樣陰性樣品和藥材三者色譜圖對(duì)比，分析共有峰來源見圖3～4。大薊止血片樣品與缺大薊樣品色譜圖對(duì)比，發(fā)現(xiàn)缺大薊樣品中未見峰1 ～11、峰13 ～14、峰16，表明14 個(gè)共有峰來源于大薊；再與大薊藥材色譜圖比較后，發(fā)現(xiàn)峰1～2、峰5、峰7～11，峰16 等9 個(gè)共有峰直接來源于大薊藥材，而峰3 ～4、峰6、峰13 ～14 等5 個(gè)共有峰來源于大薊生產(chǎn)過程產(chǎn)生。同理可知，峰12、峰17～21 等6 個(gè)共有峰直接來源于干姜藥材。峰15 來源于大薊與干姜。同時(shí)通過與對(duì)照品色譜圖對(duì)比后見圖5，發(fā)現(xiàn)峰8 為蒙花苷、峰9 為柳穿魚葉苷、峰12 為6-姜辣素、峰17 為10～姜酚。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道大薊主要紫外吸收為330 nm［9］，干姜240 nm［12-13］。因而在同一條件下，對(duì)比330、240 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)到的液相圖譜，發(fā)現(xiàn)330 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)不到干姜的成分，而在240 nm 波長(zhǎng)下基線不穩(wěn)，且色譜峰雜，峰形不好。根據(jù)大薊和干姜各自色譜峰的出峰情況， 較合適的檢測(cè)為前65 min， 檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm，65 min至檢測(cè)結(jié)束，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm。

3.2 提取條件選擇 根據(jù)工藝及檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大薊中的化學(xué)成分極性較大，而干姜中的化學(xué)成分極性較小，兩者極性差異較大；另外兩者含有量在大薊止血片中差異很大，大薊為主要藥材，大薊止血片中達(dá)到95%以上，干姜可以忽略不計(jì)?；诖耍捎煤?jiǎn)單的樣品處理方法不能檢測(cè)到干姜的成分，因此經(jīng)過多次試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，先用10%乙醇提取，中間用30%乙醇提取，最后采用無水乙醇提取，這樣2 種藥材中的成分均可檢測(cè)到。

本研究發(fā)現(xiàn)，10 批樣品21 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間差異較小，表明色譜峰出峰穩(wěn)定；從峰面積變化程度來看，各批次21 個(gè)共有峰中有多個(gè)色譜峰相對(duì)峰面積變化較大，表明不同批次各成分個(gè)體的相對(duì)量上有差異性。但指紋圖譜的建立是基于整體上辨認(rèn)樣品的真實(shí)性，樣品間的差異并沒有影響到大薊止血片指紋圖譜整體面貌的“共性特征”，不影響真實(shí)性判斷。這些個(gè)體成分量上的差異對(duì)指紋圖譜整體相似度影響不大。

圖3 大薊止血片共有峰歸屬分析圖

圖4 大薊止血片共有峰歸屬分析圖

圖5 對(duì)照品色譜圖

本實(shí)驗(yàn)利用HPLC-UV 對(duì)大薊止血片進(jìn)行分析，建立了大薊止血片指紋圖譜，既反應(yīng)了大薊成分，也反應(yīng)了干姜成分，較全面的控制大薊止血片質(zhì)量，還可通過指紋圖譜反應(yīng)不同批次間量的差異，對(duì)其質(zhì)量控制具有一定意義。