蘇黃止咳膠囊中非揮發性成分的LC-MS 分析

劉芹燕， 巫興東#， 陳 東， 李舒豐， 秦真程， 王 真， 譚寧華?

（1.中國藥科大學，中藥學院中藥制藥系，天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京211198；2.揚子江藥業集團北京海燕藥業有限公司，北京102206）

蘇黃止咳膠囊是晁恩祥教授根據多年臨床經驗，基于“風咳” 理論，研發而成的，2008 年經國家食品藥品監督管理局批準上市的中藥6 類新藥，是目前唯一一個被批準用來治療咳嗽變異型哮喘和感冒后咳嗽的中藥制劑。其處方由9 味中藥材組成，其中蜜炙麻黃、紫蘇葉為君藥；蟬蛻、地龍、五味子和炒牛蒡子為臣藥；蜜枇杷葉和前胡為佐藥；炒紫蘇子為使藥。

目前，對蘇黃止咳膠囊的研究多集中在其臨床應用［1-2］和藥理活性方面［3-4］。其臨床上的安全性和有效性已得到證實，動物試驗研究亦表明具有止咳、抗炎、平喘、祛痰及免疫調節的藥理作用［5］。蘇黃止咳膠囊中單味中藥化學成分及其生物活性研究較透徹，麻黃中的麻黃堿和偽麻黃堿具有平喘藥理作用［6］；紫蘇葉中主要為紫蘇醛等揮發油成分，具有抗炎藥理作用［7］，非揮發性成分主要為迷迭香酸和綠原酸，有抗炎作用［8-9］，另外綠原酸有免疫調節作用［9］；蟬蛻中多巴胺二聚體類成分具有抗炎藥理作用［10］；地龍中次黃嘌呤和琥珀酸具有平喘藥理作用［11］；五味子中主要為木脂素類成分，其中五味子甲素和五味子醇甲具有抗炎藥理作用［12］；牛蒡子中的牛蒡苷和牛蒡子苷元具有止咳、抗炎藥理作用［13］；枇杷葉中主要為熊果酸、齊墩果酸等三萜酸類成分，具有止咳、抗炎藥理作用［14］；前胡中主要為白花前胡甲素，具有抗炎、平喘藥理作用［15-16］；紫蘇子中的迷迭香酸具有抗炎活性［8］。

但是蘇黃止咳膠囊組方的系統化學成分的研究鮮有報道，質量控制方面也僅限于對鹽酸麻黃堿和紫蘇醛的含有量測定［17-18］，無法全面反映蘇黃止咳膠囊的化學物質基礎。前期課題組利用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS） 對蘇黃止咳膠囊及其中間體的揮發油成分進行系統分析［19］，本研究利用液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS） 將對蘇黃止咳膠囊中的非揮發性成分進行研究，以期為該藥今后的質量控制、藥效物質基礎研究、功效闡明、臨床指導合理用藥和工藝優化等提供更多的科學依據。

1 材料

1.1 儀器 Waters 1 525 分析型HPLC、Waters-Xevo TQD液質聯用儀（美國Waters 公司）；島津LC-MS-IT-TOF（日本島津公司）；SI-234 型電子分析天平［丹佛儀器（北京）有限公司］； BP211D 分析天平 （德國Sartorius 公司）；Grant XB-22 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；EYELA OSB-2100 旋轉蒸發儀（上海泉杰儀器有限公司）。

1.2 試劑 新綠原酸 （7）、隱綠原酸 （9）、維采寧-2（11）、異鼠李素3-O-β-D-半乳糖苷（16）、羅漢松樹酯酚（21）、戈米辛D（27）、五味子醇乙（28）、當歸酰戈米辛H（30）、戈米辛G（34）、五味子酯乙（41）、五味子酚（43）、苯甲酰戈米辛O（49） 購自南京元寶峰醫藥科技有限公司；檸檬酸（1）、腺苷（2）、鹽酸麻黃堿（4）、鹽酸偽麻黃堿（5）、夏佛塔苷（13）、4，5-二咖啡?？鼘幩幔?8）、白花前胡甲素（37） 購自中國食品藥品檢定研究院。綠原酸（8）、迷迭香酸（17）、牛蒡苷（20）、牛蒡子苷元（24）、五味子醇甲（26）、五味子酯甲（40）、五味子甲素（45）、五味子乙素（47） 為實驗室分離提取得到，經HPLC 檢測，所有對照品含有量均≥95%。乙腈（色譜純，德國Merck 公司）；甲醇（色譜純，上海星可高純溶劑有限公司）；甲酸［分析純，賽默飛世爾科技（中國） 有限公司］；水（純凈水，娃哈哈集團有限公司）；蘇黃止咳膠囊由揚子江藥業集團北京海燕藥業有限公司提供。

2 方法

2.1 樣品溶液制備 取膠囊3 粒，除去膠囊殼，研細混勻，取研磨后的粉末約1.0 g，精密稱定，置50 mL 錐形瓶中，加甲醇40 mL，室溫下超聲提取30 min，取出冷卻至室溫，加甲醇補足減失質量，搖勻，靜置后過濾，殘渣連同濾紙用甲醇洗滌3 次，每次3 mL，合并提取液和洗滌液置100 mL 圓底燒瓶中，減壓濃縮至干，用甲醇溶解并轉移至10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻線，搖勻，靜置后取上清液，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2 對照品溶液制備 分別稱取對照品適量，加甲醇配成適當濃度的對照品貯備液，分析前再分別取適量配成混合對照品溶液。

2.3 色譜條件 Ultimate Plus C18色譜柱（4.6 nm×250 nm，5 μm）；流動相0.01%甲酸水（A） -乙腈（B），洗脫梯度（0～10 min，5%B；10～20 min，5%～15%B；20～60 min，15%～30% B；60 ～80 min，30%～40% B；80 ～115 min，40%～70% B；115 ～125 min，70%～100% B）；體積流量（0～60 min，0.8 mL／min；60 ～80 min，0.8 ～1.0 mL／min；80～125 min，1.0 mL／min）；檢測波長205 nm；進樣量10 μL。

2.4 質譜條件

2.4.1 Waters-Xevo TQD 液質聯用儀 電噴霧（ESI） 電離源；正負離子模式全掃描；掃描范圍m／z 50 ～1 500；氮氣體積流量700 L／h；脫氣溫度450 ℃；毛細管電壓3.0 kV（ESI+），1.5 kV（ESI-）；毛細管溫度500 ℃；噴霧電壓3 kV；錐孔電壓40 V；霧化氣體積流量650 L／h；輔助氣體積流量50 L／h；碰撞能量32 V；三分通流2 ∶1。

2.4.2 島津LCMS-IT-TOF 電噴霧（ESI） 電離源；正負離子模式全掃描；掃描范圍m／z 100 ～1 000；毛細管電壓4.5 kV（ESI+），3.5 kV（ESI-）；毛細管溫度200 ℃；噴氣體積流量1.5 L／min；干燥氣壓力104.0 kPa；檢測器電壓1.58 kV；碎裂方式為碰撞誘導解離（CID）；碰撞能量50%。

3 結果

蘇黃止咳膠囊提取液的液相色譜圖和正、負離子模式下的總離子流圖見圖1，所有化合物的結構見圖2，所鑒定的化合物的保留時間、分子式、質譜數據和藥材來源歸屬見表1，其中表中的一級質譜數據由Waters-Xevo TQD 獲得，多級質譜數據由LCMS-IT-TOF 獲得。共分析和鑒定出50 個化合物，包括4 個生物堿、8 個酚酸、5 個黃酮、2 個香豆素、29 木脂素和2 個其他類型化合物，其中有27 個化合物和對照品進行對照確認，另外對檢測到的化合物的裂解途徑進行了總結。

圖1 蘇黃止咳膠囊液相色譜圖與總離子流圖

圖2 化合物結構式

表1 化學成分鑒定

續表1

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3.1 生物堿類 通過質譜碎片分析及對照品保留時間比對，共有4 個生物堿類化合物（3 ～6） 在正離子模式下被鑒定出，均來自麻黃，主要裂解途徑為丟失一分子水。

通過和對照品對照后，化合物4～5 分別確定為麻黃堿和偽麻黃堿。以麻黃堿（4） 為例，其裂解途徑見圖3。其準分子離子峰均為m／z 166［M+H］+，一級質譜中均有明顯的脫水峰m／z 148［M+H-H2O］+，然后在二級質譜中分別失去一分子甲基和氨甲基后形成m／z 133［M+H-H2OCH3］+和m／z 117［M+H-H2O-CH3NH2］+的碎片離子。化合物3 和6 的準分子離子峰為m／z 152［M+H］+和m／z 180［M+H］+，分別比麻黃堿少一分子甲基和多一分子甲基。因此，化合物3 和6 推斷是去甲基（偽） 麻黃堿和甲基（偽） 麻黃堿［25］。

3.2 酚酸類 共8 個酚酸類化合物（7～10、12、15、17～18） 在負離子模式下被鑒定出來。其中，有5 個化合物通過和對照品的保留時間和質譜數據對照后確認，分別是新綠原酸（7）、綠原酸 （8）、隱綠原酸 （9）、迷迭香酸（17） 和4，5-二咖啡酰奎寧酸（18），這類化合物主要裂解途徑為酯基的酰氧鍵斷裂。

化合物7～9 和18 的結構類似，具有相似的裂解途徑。以隱綠原酸（9） 為例，其裂解途徑見圖4。隱綠原酸在負離子模式下的準分子離子峰為m／z 353［M-H］-，隱綠原酸結構中C-4 位連有一個咖啡?；苋菀紫壬蒻／z 191［quinic-H］-的碎片離子，然后再脫水生成m／z 173［quinic-H-H2O］-的基峰碎片離子［49］。隱綠原酸的二級質譜中還有m／z 179［caffeic-H］-的碎片離子，然后再失去一分子CO2生成m／z 135［caffeic-H-CO2］-的碎片離子。

圖3 麻黃堿裂解途徑

圖4 隱綠原酸裂解途徑

化合物15 的準分子離子峰為m／z 521［M-H］-，二級質譜中的基峰為m／z 359［M-H-162］-，推測可能失去一分子葡萄糖，三級質譜中，進一步裂解生成m／z 197 和161的碎片離子，和迷迭香酸（17） 的碎片離子一致，推測化合物15 可能是迷迭香酸苷［36］。

化合物10 的準分子離子峰為m／z 337［M-H］-，二級質譜的基峰為m／z 191［quinic-H］-。推測化合物10 可能是肉桂酰奎尼酸［29-30］。

化合物12 在正離子模式下有2 個加合離子峰，分別為m／z 349［M+Na］+和m／z 365［M+K］+，負離子模式下的準分子離子峰為m／z 325［M-H］-，可推測此化合物的分子量為326。二級質譜中，m／z 325 的離子生成m／z 163［M-HGlc］-和m／z 119［M-H-Glc-CO2］-的碎片離子。通過和文獻中的質譜數據對比后［30］，化合物12 推測為nebrodenside B。3.3 黃酮類 一共5 個黃酮類化合物（11、13 ～14、16、25） 在負離子模式下被鑒定出來，其中化合物11 和13 為黃酮C-苷，化合物14、16 和25 為黃酮O-苷。這些化合物主要來自麻黃和枇杷葉。

3.3.1 黃酮C-苷 這類化合物的主要裂解途徑為失去60、90、120 Da 等碎片［50］。通過和對照品對照，化合物11、13確定是維采寧-2 和夏佛塔苷。以夏佛塔苷（13） 為例，其裂解途徑見圖5。夏佛塔苷的準分子離子峰為m／z 563［MH］-，在二級質譜中生成m／z 503［M-H-60］-、m／z 473［M-H-90］-、 m／z 443［M-H-120］-、 m／z 383［M-H-120-60］-和m／z 353［M-H-120-90］-的碎片離子。三級質譜中，m／z 353 的離子通過連續失去CO 生成m／z 325［M-H-120-90-CO］-和297［M-H-120-90-2CO］-的碎片離子。

3.3.2 黃酮O-苷 黃酮O-苷主要裂解途徑為失去葡萄糖或半乳糖（162 Da） 或鼠李糖（146 Da）［51］。化合物16 通過和對照品對照后確認為異鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷，可能的裂解途徑見圖6。異鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷的準分子離子峰為m／z 477［M-H］-，二級質譜中生成m／z 462［M-H-CH3］-、m／z 315［M-H-162］-、m／z 300［M-H-162-CH3］-、m／z 299［M-H-162-CH3-H］-、m／z 271［M-H-162-CH3-H-CO］-和m／z 255［M-H-162-CH3-H-CO2］-的碎片離子。其中基峰為m／z 299，是m／z 300 的碎片峰在高電離能下失去一分子H 而產生的。三級質譜中，m／z 299 的離子通過單獨或連續中性丟失CO 和CO2生成m／z 271、255、227 和199 的碎片離子?；谙嗨频牧呀馔緩讲⑼ㄟ^和文獻中的質譜數據對比［35］，化合物14 推測為槲皮素-4′-O-β-D-半乳糖苷。

化合物25 的分子離子峰為m／z 577［M-H］-，二級質譜中有2 個特征性離子峰，分別為m／z 431［M-H-146］-和m／z 285［M-H-292］-，其中m／z 285 的碎片離子峰為基峰，與山柰酚的質譜碎片相同?；衔?5 的洗脫時間明顯比其它黃酮類化合物的洗脫時間長很多，和文獻里的數據一致［43］，化合物25 推測是4″-trans-p-coumaroyl-kaempferol-3-O-α-L-rhamnoside。

3.4 香豆素類 共2 個香豆素類化合物（36～37） 在正離子模式下被檢測到，主要來自前胡。都屬于3′，4′-二酰氧基取代開洛酮類香豆素，特征碎片離子為m／z 227［46］。

化合物37 通過和對照品對照后確認是白花前胡甲素，其裂解途徑見圖7。根據文獻［46］可知，香豆素結構上的4′位取代基容易先脫去，然后再脫去3′位取代基。先是4′位失去中性碎片CH3COONa（82 Da） 生成m／z 327 的碎片離子，然后在3′位失去中性碎片C4H7COOH（100 Da） 生成m／z 227 的碎片離子，再通過凱林內酯骨架丟失CO 產生m／z 199 的碎片離子［52］?；衔?6 和白花前胡甲素有相似的裂解途徑，推測是白花前胡香豆精Ⅱ［46］。

圖5 夏佛塔苷裂解途徑

圖6 異鼠李素-3-O-β-D-半乳糖苷裂解途徑

圖7 白花前胡甲素裂解途徑

3.5 木脂素類 29 個木脂素類化合物被鑒定出，其中有6個木脂素類化合物（19～24） 來自牛蒡子，23 個木脂素類化合物（26～35、38 ～50） 來自五味子。牛蒡子中的木脂素主要屬于二芐基丁內酯型木脂素，比較容易在負離子模式下檢測到，部分化合物也可以在正離子模式下檢測到；五味子中的木脂素主要屬于聯苯環辛二烯類木脂素，均在正離子模式下檢測到。

3.5.1 牛蒡子中的木脂素 這類木脂素都有相似的裂解途徑，在正離子模式下主要脫去H2O，在負離子模式下主要脫去CH3和CO2。通過和對照品的保留時間和質譜數據對照后，化合物20～21、24 分別被鑒定為牛蒡苷、羅漢松樹脂酚和牛蒡子苷元。以牛蒡苷（20） 為例，其裂解途徑見圖8。在正離子模式下的一級質譜給出了2 個加合離子m／z 557［M+Na］+和m／z 573［M+K］+，二級質譜中通過脫去一分子葡萄糖生成m／z 395［M+Na-Glc］+和m／z 373［M+HGlc］+的碎片離子，m／z 373 的碎片離子通過失去一分子水生成m／z 355［M+H-Glc-H2O］+的碎片離子，m／z 137 和m／z 237 的碎片離子是芐基的C7-C8 位鍵斷裂后形成的，m／z 237 的碎片離子進一步脫水生成m／z 219 的碎片離子。負離子模式下的一級質譜給出了一個加合離子m／z 579［M+HCOO］-，二級質譜中通過失去HCOOH 生成m／z 533［MH］-的準分子離子峰，繼續裂解生成m／z 371［M-H-Glc］-的碎片離子，然后再裂解分別生成m／z 356［M-H-Glc-CH3］-和m／z 312［M-H-Glc-CH3-CO2］-的碎片離子。

圖8 牛蒡苷裂解途徑

化合物19 比羅漢松樹脂酚（21） 的分子量多162，應該是多一分子葡萄糖，推測19 是羅漢松樹脂酚苷［39］。

化合物22～23 的正離子模式下有2 個加合離子m／z 559［M+Na］+和m／z 575［M+K］+，負離子模式下有一個準分子離子峰m／z 535［M-H］-，因此也可判斷出其分子量均為536，且互為同分異構體。兩者均有m／z 517［M-H-H2O］-、m／z 505［M-H-CH2O］-、m／z 502［M-H-H2O-CH3］-的碎片離子峰，根據文獻中報道的關于它們在液相中的洗脫順序［42］，可推測分別是異牛蒡酚A 和牛蒡酚A。

3.5.2 五味子中的木脂素 通過和對照品的保留時間和質譜數據對照，一共11 個木脂素（26～28、30、34、40～41、43、45、47 和49）。通過研究這幾個化合物的質譜碎片和裂解途徑，總結出這類木脂素的C-1、C-14 和八元環（C-6、C-7、C-8 和C-9） 是其活性部位，這些位置上的取代基比較容易脫去。由于在聯苯環辛二烯類木脂素的苯環上存在很多甲氧基基團。因此，連續地丟失甲基和甲氧基是其主要裂解途徑。由于位阻效應，C-1 和C-14 位的甲氧基基團活性較強，比較容易失去［53］。這類木脂素一般比較容易失去CH3（15 Da）、H2O（18 Da）、CH3O（31 Da）、C3H6（42 Da）、C2H4O（44 Da）、C5H10（70 Da）、C5H8O2（100 Da）、C7H6O2（122 Da） 和C6H10O3（130 Da）。

以當歸酰戈米辛H（30） 為例，其裂解途徑見圖9。其一級質譜給出2 個加合峰m／z 523［M+Na］+和m／z 539［M+K］+，除此之外，一級質譜中還發現了m／z 483［M+HH2O］+和m／z 401［M+H-C5H8O2］+的碎片離子，分別是C-8位脫水和C-1 位脫去當歸酸（100 Da） 而生成的。二級質譜中，m／z 401 的離子通過單獨或連續失去H2O、CH3、CO和CH3O 中性碎片生成m／z 386、370、355、337、327、322和309 的碎片離子峰。

基于相似的裂解途徑，化合物29、31 ～33、35、38 ～39、42、44、46、48、50 分別被鑒定出［45-48］。

3.6 其他化合物 化合物1 的一級質譜給出準分子離子峰m／z 191［M-H］-。二級質譜中，生成m／z 173［M-H-H2O］-和m／z 111［M-H-2H2O-CO2］-的碎片離子。通過和對照品對照后確認為是檸檬酸。

化合物2 的一級質譜給出準分子離子峰m／z 268［M+H］+。二級質譜通過失去一分子戊糖（132 Da） 生成m／z 136 的碎片離子。通過和對照品對照后確認是腺苷。

4 結論

圖9 當歸酰戈米辛H 裂解途徑

本文采用液質聯用技術建立了蘇黃止咳膠囊中非揮發性成分的定性分析方法。采用該方法，分析和鑒定了蘇黃止咳膠囊提取物中的50 個化學成分，并對這些化合物進行了藥材來源歸屬。這些化合物中包括4 個生物堿、8 個酚酸、5 個黃酮、2 個香豆素、29 個木脂素和2 個其他類型化合物，其中27 個化合物通過和對照品對照后確認。鑒定出的化合物大部分為木脂素，主要來自五味子。該結果基本闡明了蘇黃止咳膠囊的化學物質基礎，以期為后續的質量控制和藥效物質基礎研究奠定基礎。