五味子乙素對AngⅡ誘導心肌纖維化中AkT、mTOR、TGF-β1 表達的影響

滕春曉， 金紅花，2?， 洪 蘭

（1.延邊大學藥學院，吉林 延吉133000；2.延邊大學附屬醫院藥學部，吉林 延吉133000；3.延邊大學醫學院生理學與病理生理學教研部，吉林 延吉133000）

高血壓、心肌梗死、心肌炎等疾病均可導致心室重構、心肌細胞凋亡等病理生理改變，進而發展為慢性心力衰竭，心肌纖維化是其病理基礎［1］，它是以心肌成纖維細胞過度增殖、膠原蛋白生成增加、細胞外基質過度失衡與沉積為主要表現的疾病［2］。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統在大多數心血管系統疾病中發生活化，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ） 能促進心肌成纖維細胞增殖，膠原生成增多［3］，與心肌纖維化密切相關。五味子乙素是五味子主要藥用成分木脂素的成員之一［4］，對心臟有保護作用，但目前尚未明確其作用機制［5］。因此，本實驗考察五味子乙素對AngⅡ誘導心肌纖維化中AkT、mTOR、TGF-β1 表達的影響。

1 材料

1.1 動物 出生1～3 天的SD 大鼠乳鼠，由延邊大學實驗動物中心提供， 動物生產許可證號碼 SCXK （吉）2017-0003。

1.2 試藥 五味子乙素購自上海源葉生物科技有限公司，批號P29J8F38066；AngⅡ購自瑪雅試劑有限公司，批號MAYA-CR-7157；胎牛血清（FBS） 購自美國Gemini 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、磷酸鹽緩沖液（PBS） 購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM、雙抗（青霉素-鏈霉素溶液）、0.25%胰蛋白酶-EDTA、Ⅱ型膠原酶購自美國Gibco 公司；轉化生長因子-β1（TGF-β1）、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）、蛋白激酶B（AkT）、雷帕霉素購自英國Abcam 公司；雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR、p-AKT 購自美國Cell Signaling Technology 公司；β-actin 購自北京博奧森生物技術有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗購自長春納川科技發展有限公司；牛血清白蛋白（BSA） 購自美國Sigma 公司。

1.3 儀器 371 CO2細胞培養箱購自賽默飛世爾科技（中國）公司；IX70-112 倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司；EON 酶標儀購自美國BioTek 公司；WE-180B 垂直電泳儀、VE-186 轉移電泳儀購自上海天能科技有限公司；Fluor chemuon 凝膠成像儀購自美國Protein Simple 公司。

2 方法

2.1 細胞分離 14 只乳鼠浸入75%乙醇5 min 后取出，在超凈工作臺中將其胸部向上，小剪刀剪開乳鼠胸腔，充分露出心臟，放入37 ℃預熱的PBS 中，剔除大血管等組織，留取心尖部心室組織，PBS 洗滌1 次，剪碎（＜1 mm3）后移到50 mL 離心管中，棄去PBS，加入4 mL 0.1%Ⅱ型膠原酶消化液，于37 ℃水浴消化10 min 后棄上清，剩余沉淀物用Ⅱ型膠原酶消化液搖動消化4 次，每次10 min，收集上層細胞懸液，加入等量培養基終止反應。將消化的細胞懸液收集到50 mL 離心管中，1 200 r／min 離心5 min，棄去上層液體，加入4 mL 培養基，移液管輕柔多次吹打，調整細胞密度，使細胞重新均勻懸浮后接種到培養皿中，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養60 min 進行差速貼壁，吸出培養基，PBS 洗滌3 次去除血污，加入培養基繼續培養細胞。

2.2 分組 將心肌成纖維細胞用含0.1% FBS、3%雙抗的DMEM 高糖培養基培養6 h 進行同化實驗。①對照組，不作任何處理；②AngⅡ組，1×10-7mol／L AngⅡ處理細胞1、24 h；③AngⅡ+五味子乙素低劑量組，1×10-7mol／LAngⅡ和2.5×10-5mol／L 五味子乙素處理細胞1、24 h；④AngⅡ+五味子乙素高劑量組，1×10-7mol／L AngⅡ和7.5×10-5mol／L 五味子乙素處理細胞1、24 h；⑤AngⅡ+雷帕霉素組，1×10-7mol／L AngⅡ和1×10-8mol／L 雷帕霉素處理細胞1、24 h。

2.3 Western blot 檢測 BCA 蛋白濃度法測定心肌成纖維細胞總蛋白量。每個孔中加入50 μg 蛋白質，用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜上，1%BSA 磷酸鹽緩沖液（PBST） 中室溫封閉2 h，分別加入1 ∶1 000 兔抗mTOR、p-mTOR、AkT、TGFβ1、Collagen Ⅰ；1 ∶2 500 兔抗β-actin；1 ∶5 000 兔抗p-AkT，4 ℃冰箱中搖動孵育過夜，PBST 中洗膜10 min（3次），加入二抗（1 ∶3 500），室溫下振搖2 h，PBST 洗膜10 min （3 次）。 然 后， 加 入 ECL 試 劑 發 光， 通 過FluorChem FC3 軟件進行灰度值掃描，并分別與β-actin 灰度值比較。

2.4 統計學分析 通過SPSS17.0 軟件處理，計量資料以表示，2 組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1細胞形態學特征 圖1 顯示，培養60 min 后大多數心肌成纖維細胞基本完成貼壁，生長出偽足且伸展為梭形，零星分散生長。心肌成纖維細胞生長迅速，可在2 ～3 d 內基本達到培養皿的80%～90%，細胞排列均勻緊密，沒有自發性搏動，呈長梭形或者多邊形，細胞體比較大且胞質澄明，細胞核清晰碩大。

圖1 第2 代心肌成纖維細胞（×100）

3.2 五味子乙素對p-AkT 蛋白表達的影響 圖2 顯示，與對照組比較，Ang Ⅱ組p-AkT 蛋白表達顯著下調 （P ＜0.05）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+五味子乙素組其蛋白表達顯著上調（P＜0.05）。

圖2 五味子乙素對p-AkT 蛋白表達的影響

3.3 五味子乙素對p-mTOR 蛋白表達的影響 圖3 顯示，與對照組比較，AngⅡ組p-mTOR 蛋白表達顯著上調（P＜0.05）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+五味子乙素組其蛋白表達顯著下調（P＜0.05）。

圖3 五味子乙素對p-mTOR 蛋白表達的影響

3.4 五味子乙素對TGF-β1、CollagenⅠ蛋白表達的影響圖4 顯示，與對照組比較，AngⅡ組TGF-β1、CollagenⅠ蛋白表達顯著上調（P＜0.05）；與AngⅡ組比較，AngⅡ+五味子乙素組兩者蛋白表達顯著下調（P＜0.05）。

4 討論

本實驗以AngⅡ為刺激因子建立心肌纖維化模型，發現與對照組比較處理后心肌成纖維細胞可使p-mTOR、TGF-β1 和CollagenⅠ表達明顯升高，p-AkT 表達明顯降低；與Ang Ⅱ組 比 較， 五 味 子 乙 素 組 （2.5×10-5、 7.5×10-5mol／L） 組發生明顯逆轉。由此證實，五味子乙素可呈劑量依賴性地下調p-mTOR、TGF-β1、CollagenⅠ蛋白表達，上調p-AKT 蛋白表達來改善AngⅡ誘導的心肌纖維化。

五味子性味酸、甘，溫，歸肺、心、腎經，功效收斂固澀、益氣生津、補腎寧心［6］，具有安定心神的功效，適用于心神不安之失眠多夢、心悸等，對心氣不足者，可補益心氣［7］；對心腎陰虛者，又能滋養心腎，常與滋陰養血、補心安神之品配伍［8］。五味子乙素為五味子主要活性成分之一，對心肌缺血具有保護作用，可減輕氧自由基的侵害，抑制心肌細胞凋亡，維持心血管舒張功能，對DOX 誘導的心臟毒性具有保護作用［9］，還可通過降低TGF-β1 蛋白表達來起到抗腎纖維化的作用［10］。本實驗發現，該成分可改善心肌纖維化。

當心肌損傷時，心肌成纖維細胞異常增殖，并分泌大量膠原蛋白，病理性細胞外基質積聚，引起心肌膠原過量聚集且膠原比列失調，最終導致心肌纖維化［11-12］；AngⅡ可促進心肌成纖維細胞增殖、分化、合成，并分泌大量細胞外基質蛋白，通過與其受體結合后能活化細胞內一系列信號通路，在心肌纖維化中具有重要作用［3］。 活化的mTOR 信號通路參與纖維化病變，抑制該信號通路時可通過減少細胞外基質表達來抑制纖維化形成［13］，它作為該信號通路中最主要的信號分子，參與了多種生理、病理過程，不僅具有蛋白激酶功能，而且在反映生長因子、營養狀況的細胞信號傳導途徑中起著重要調控作用［14］，而且體外TGF-β1 誘導的原代人肺成纖維細胞纖維化模型與mTORC1活性升高，膠原、纖維黏連蛋白分泌增多有關［15］。本實驗發現，五味子乙素可使mTOR 磷酸化水平降低，從而起到改善心肌纖維化的作用。

圖4 五味子乙素對TGF-β1（A）、CollagenⅠ（B） 蛋白表達的影響

AkT 作為mTOR 信號通路的上游效應因子之一，參與心臟中多種細胞凋亡、代謝和心力衰竭發生發展［16］，有研究表明［17］，通過調控心肌細胞PI3K／AkT 信號通路可對AngⅡ誘導心肌細胞肥大起保護作用；本實驗發現，AkT 參與心肌成纖維細胞中AngⅡ誘導的心肌纖維化。TGF-β 在細胞生長與分化、炎癥、纖維化、腫瘤發生發展中發揮重要作用，其中與心肌纖維化密切相關的因子是TGF-β1，它可通過TGF-β／Smads 信號通路參與調節心肌成纖維細胞增殖、轉化、遷移及細胞外基質合成與沉積，是促心肌纖維化的最主要因素之一［18-19］；本實驗發現，五味子乙素在AngⅡ誘導的心肌纖維化中可通過下調TGF-β1 表達來發揮作用，而且TGF-β 與AngⅡ組成的工作網在纖維化形成中有著至關重要的作用，同時與其他信號通路相互影響［1］。雷帕霉素可抑制TGF-β 信號通路，并減少Collagen Ⅰ分泌［20］；本實驗發現，該藥物可使TGF-β1、CollagenⅠ蛋白表達降低，從而改善心肌纖維化。

綜上所述，五味子乙素可通過促進AkT 磷酸化，抑制p-mTOR、TGF-β1 蛋白表達，減少CollagenⅠ合成，從而呈劑量依賴性的抑制AngⅡ誘導的心肌纖維化，可為該成分在心臟保護方面的研究提供參考，也為未來相關臨床治療拓展新思路。