斑蝥素酸鎂誘導BEL-7402 人肝癌細胞凋亡的機制

黃渝茜， 晏旭航， 晏 容，， 劉 云， 楊明潔， 陳威天， 古宸廷， 李 埝，羅明星， 李曉飛，?

（1.遵義醫學院基礎醫學院，貴州 遵義563000；2.遵義醫學院貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治特色重點實驗室，貴州 遵義563000）

斑蝥是一種重要的抗腫瘤蟲類中藥，對原發性肝癌可達到良好效果［1-2］。課題組前期研究發現，斑蝥體內含有游離斑蝥素和斑蝥素鹽類物質，主要包括斑蝥素酸鈣、斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鉀等［3-4］，其中斑蝥素酸鎂對肝癌治療效果較游離斑蝥素和其他斑蝥素鹽類物質效果更佳［5-7］；后續研究發現，經過斑蝥素酸鎂作用后肝癌細胞出現凋亡現象［8-9］，但具體機制不清。因此，本實驗觀察斑蝥素酸鎂對人肝癌細胞BEL-7402 增殖抑制和凋亡誘導作用，并與同為蛋白磷酸酶2 A（PP2A） 抑制劑的促癌物岡田酸進行比較，探討斑蝥素酸鎂的抗肝癌機制，為其進一步研發提供依據。

1 材料

1.1 試藥 斑蝥素酸鎂是將斑蝥素與氫氧化鎂反應制備而來，干燥后得到白色結晶粉末，含有量在90%以上；斑蝥素酸鎂由課題組自主合成，制備方法已授權國家發明專利（ZL201110149288.5）［10］。 岡田酸購自美國Sigma公司。BEL-7402 人肝癌細胞株購自中國科學院上海細胞庫；RMPI-1640 購自美國Gibco 公司；胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自美國HyClone 公司；活性氧（ROS）、線粒體膜電位、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、HRP 標記山羊抗兔二抗、HRP 標記羊抗鼠二抗購自上海碧云天生物技術有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自美國Thermo 公司；兔抗細胞外調節蛋白激酶（ERK1／2） 單克隆抗體、兔抗磷酸化ERK1／2多克隆抗體、兔抗Cyt-C 多克隆抗體、小鼠抗半胱天冬酶-3（Caspase-3） 單克隆抗體、兔抗裂解半胱天冬酶-3（Cleaved-Caspase-3） 多克隆抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 儀器 3131 型CO2培養箱、Multiskan spectrum 全波長酶標儀，購自美國Thermo 公司；超凈工作臺，購自蘇州凈化設備有限公司；FC500 MCL 流式細胞儀，購自美國Beckman 公司；mini protean 3 cell 電泳儀，購自美國Bio-Rad 公司；SP-9 型電轉儀，購自大連競邁科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養 完全培養基（RPMI1640） 培養細胞，并置于37 ℃、5%CO2培養箱中，待細胞在培養瓶長成致密單層時用于后續實驗。

2.2 磺酰羅丹明B（SRB） 染色法 將對數生長期細胞接種于96 孔板中，1 塊作為對照組（T0），另1 塊作為實驗組（T）。培養20 h 后將T0取出，預冷的50%三氯乙酸（TCA）固定［11］，實驗板中加入不同濃度（1.668、3.336、5.004、6.672 μmol／L） 斑蝥素酸鎂，同時以加入等量培養基的腫瘤細胞作為空白對照組（C），實驗組、空白對照組分別設5 個復孔，培養24 h 后參照文獻［12］ 報道進行固定、染色、溶解，于530 nm 處測定光密度（OD） 值，計算細胞生長抑制率，公式為生長抑制率= ［1-ODT-ODT0／ODC-ODT0］ ×100% （設置對照組是為了排除加藥前細胞生長速度差異對最終細胞生長的影響，能更好地反映藥物對腫瘤細胞增殖的抑制作用）。

2.3 細胞凋亡率檢測 細胞按1×104／孔密度接種于6 孔板，37 ℃、5%CO2培養箱中培養20 h，再分別加入配置好的岡田酸 （終濃度0.072 nmol／L） 和不同濃度 （2.43、4.86、9.72 μmol／L） 斑蝥素酸鎂，對照組加等量培養基，每組平行3 次，37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h。然后，采用Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，流式細胞儀進行檢測，Annexin V-FITC 為綠色熒光，對應BD 流式細胞儀FL1 檢測通道；碘化丙啶（PI） 為紅色熒光，對應BD 流式細胞儀FL2 檢測通道。

2.4 活性氧（ROS） 水平檢測 同法培養細胞和分組，按照ROS 檢測試劑盒說明進行操作。收集細胞后，加入500 μL DCFH-DA 工作液（10 μmol／L），無血清細胞培養液洗滌細胞1～2 次，流式細胞儀檢測熒光信號，通過CXP軟件進行分析。

2.5 線粒體膜電位檢測 同法培養細胞和分組，按照線粒體膜電位檢測試劑盒說明進行操作。收集細胞后，加入0.5 mL JC-1 染色工作液，顛倒數次混勻，細胞培養箱中37 ℃下孵育20 min，37 ℃孵育結束后，4 ℃下600×g 離心3～4 min，沉淀細胞，棄上清后用預先配置好的JC-1 染色緩沖液 （1X） 洗滌2 次，加入1 mL JC-1 染色緩沖液（1X） 重懸細胞，4 ℃下600×g 離心3 ～4 min，沉淀細胞，棄上清，再加入1 mL JC-1 染色緩沖液（1X） 重懸細胞，4 ℃下600×g 離心3～4 min，沉淀細胞，棄上清，適量JC-1染色緩沖液（1X） 重懸后上流式細胞儀檢測［13］。然后，通過CXP 分析軟件進行分析。

2.6 細胞色素c（Cyt-C）、半胱天冬酶-3（Caspase-3）、裂解半胱天冬酶-3（Cleaved-Caspase-3）、細胞外調節蛋白激酶（ERK1／2） 蛋白磷酸化表達檢測 采用Western blot 法。細胞加藥培養24 h 后棄上清，收集細胞，RIPA 裂解，提取蛋白。BCA 定量后，20 μg 提取蛋白進行SDS-PAGE 電泳，半干式電轉至硝酸纖維素膜后室溫封閉1 h，一抗（GAPDH，1 ∶ 10 000； ERK1／2，1 ∶ 1 000； p-ERK1／2，1 ∶1 000；Cyt-C， 1 ∶ 1 000； Caspase-3， 1 ∶ 1 000；Cleaved-Caspase-3，1 ∶800）4 ℃下孵育過夜，TBST 漂洗3次，每次5 min，置于HRP 標記羊抗兔二抗（或HRP 標記羊抗鼠二抗） （1 ∶10 000）37 ℃下孵育1 h，TBST 漂洗3次，每次5 min，將其浸入ECL 液中2 min。最后，X 光膠片進行曝光、顯影、定影，并進行灰度分析。

2.7 統計學方法 通過SPSS 17.0 軟件進行處理，數據用表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示有顯著性差異。

3 結果

3.1 斑蝥素酸鎂對BEL-7402 人肝癌細胞的抑制作用 圖1 顯示，1.668 μmol／L 斑蝥素酸鎂對細胞有明顯抑制作用，并隨著其濃度升高抑制率逐漸增大。以斑蝥素酸鎂濃度為橫坐標（X），縱坐標為抑制率（Y） 進行回歸，得方程為Y=13.765X-16.95（R2=0.995 4），IC50為4.86 μmol／L。

3.2 斑蝥素酸鎂對BEL-7402 人肝癌細胞凋亡率的影響圖2 顯示，斑蝥素酸鎂組細胞凋亡率與對照組比較均顯著增加（P＜0.01），并呈濃度依賴效應，但岡田酸組顯著減少（P＜0.01）。

3.3 斑蝥素酸鎂對ROS 水平的影響 圖3 顯示，與對照組比較，2.43 μmol／L 斑蝥素酸鎂組ROS 水平顯著增加（P＜0.01），并呈濃度依賴效應，但岡田酸組顯著減少（P＜0.05）。

圖1 斑蝥素酸鎂對BEL-7402 人肝癌細胞的抑制作用

圖2 斑蝥素酸鎂對BEL-7402 人肝癌細胞凋亡率的影響

3.4 斑蝥素酸鎂對線粒體膜電位的影響 圖4 顯示，斑蝥素酸鎂組線粒體膜電位與對照組比較均顯著降低 （P ＜0.01），并呈濃度依賴效應，但岡田酸組無顯著變化（P＞0.05）。

圖3 斑蝥素酸鎂對ROS 水平的影響

圖4 斑蝥素酸鎂對線粒體膜電位的影響

3.5 斑蝥素酸鎂對Cyt-C、Cleaved Caspase-3、Caspase-3 蛋白表達的影響 圖5 顯示，與對照組比較，2.43 μmol／L 斑蝥素酸鎂組Cyt-C、Cleaved-Caspase-3、Caspase-3 蛋白表達顯著上調（P＜0.01），并呈濃度依賴效應，但岡田酸組顯著下調（P＜0.01）。

圖5 斑蝥素酸鎂對Cyt-c、Cleaved Caspase-3、Caspase-3 蛋白表達的影響

3.6 斑蝥素酸鎂對ERK1／2 蛋白磷酸化表達的影響 圖6顯示，與對照組比較，2.43 μmol／L 斑蝥素酸鎂組ERK1／2蛋白磷酸化表達顯著下降（P＜0.01），并呈濃度依賴效應，但岡田酸組顯著上升（P＜0.01）。

4 討論

細胞凋亡是一種多種基因調控的主動程序化死亡過程，經典的途徑分為3 條，包括死亡受體、線粒體凋亡、內質網應激［14］，其中在動物細胞中線粒體途徑是最普遍的凋亡機制和細胞凋亡核心［15］。在細胞凋亡過程中，線粒體產生大量ROS，引起線粒體膜電位下降，cyt-C 釋放到細胞漿中，從而激活半胱天冬酶-9（Caspase-9）， 并激活下游Caspase-3［16-17］，它是Caspase 家族重要組成部分，在凋亡過程中充當凋亡執行蛋白者的角色［18-19］，而Caspase-3 活化過程中能產生Cleaved Caspase-3，其活性和細胞凋亡情況可由表達程度反映［20］，本實驗發現2.43 μmol／L 斑蝥素酸鎂作用24 h 后能顯著升高肝癌細胞內ROS 水平，具有濃度依賴效應。細胞凋亡過程中首先會引起活性氧大量增加，線粒體功能發生障礙，釋放cyt-C［17］，本實驗發現斑蝥素酸鎂組線粒體膜電位明顯下降，cyt-C 表達明顯升高，符合上述理論。在此基礎上，又檢測凋亡執行蛋白Caspase-3、Cleaved Caspase-3 蛋白表達，發現斑蝥素酸鎂組兩者明顯升高，具有濃度依賴效應，表明該成分可能通過線粒體凋亡途徑來誘導BEL-7402 人肝癌細胞發生凋亡。

圖6 斑蝥素酸鎂對ERK1／2 蛋白磷酸化表達的影響

課題組前期發現，斑蝥素酸鎂能顯著下調人肝癌細胞SMMC-7721 的ERK1／2 磷酸化水平，提示ERK1／2 通路可能在該成分抑制肝癌細胞生長中發揮重要作用。細胞外信號調節激酶1／2（ERK1／2） 是細胞內重要的信號蛋白，屬于增殖相關蛋白激酶（MAPK），在調控細胞凋亡中發揮重要作用［21］，前期報道苦參堿衍生物WM130 誘導肝癌細胞凋亡與ERK1／2 通路的抑制密切相關［22］，本實驗結果與其相符，即2.43 μmol／L 斑蝥素酸鎂組ERK1／2 蛋白磷酸化表達顯著下調，具有濃度依賴效應，而細胞凋亡率卻明顯升高，提示ERK1／2 通路可能與斑蝥素酸鎂誘導的BEL-7402人肝癌細胞凋亡呈負相關。

研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK） 信號通路可以將凋亡信號傳遞給線粒體［23］，線粒體凋亡途徑主要包含B 淋巴細胞瘤-2 基因（Bcl-2） 家族成員，它和BCL-2-Associated X 的蛋白質（Bax） 在細胞中凋亡中發揮著重要的調節作用［24］。據文獻［25］ 報道，大黃素能抑制細胞中ERK1／2 磷酸化，隨之Bcl-2 表達下調，cyt-C 釋放到胞漿，最終引起Caspase-3 活化，引起細胞凋亡的發生；本實驗發現，斑蝥素酸鎂可明顯降低線粒體膜電位，導致cyt-C 釋放，進而激活Caspase-3，同時還能明顯抑制ERK1／2 磷酸化水平，故推測斑蝥素酸鎂可能通過抑制ERK1／2 磷酸化水平，反向調節線粒體凋亡途徑，最終誘導BEL-7402 人肝癌細胞發生凋亡，但對ERK1／2 通路具體調節線粒體凋亡途徑的機制還有待進一步研究。