補腎益元方對運動性低血睪酮大鼠睪丸Leydig 細胞睪酮合成酶的影響

王一蓉， 周志宏， 湯長發， 魏 霞， 葉志文

（1.湖南體育職業學院，湖南 長沙410019；2.湖南師范大學體育學院，湖南 長沙410081）

運動性低血睪酮一直是競技體育界最關心的問題，長時間高負荷運動訓練能引起血睪酮水平下降，進而導致體能、運動能力降低或產生疲勞［1］，其主要原因是HPG 軸功能的多個環節被抑制［2］。目前，在睪丸Leydig 細胞水平層面，因LH／CG 受體、P450SCC、β2-腎上腺素受體等環節改變引起睪酮降低均有報道，但鮮有關注運動訓練、營養干預對睪酮生物合成途徑相關酶的影響。

睪丸Leydig 細胞含有較多的內質網和線粒體，是合成和分泌睪酮的場所。下丘腦-垂體對睪丸分泌睪酮的調節變化最終要通過細胞內睪酮合成時反應底物轉運、酶促反應等幾個關鍵步驟實現。膽固醇作為睪酮生物合成的起始物質，其來源的主要途徑為膽固醇內源性合成、外源性膽固醇攝取和逆轉運， 而甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（HMG-CoA）、低密度脂蛋白受體（LDL-R）、高密度脂蛋白受體（SR-BI） 分別是這2 條途徑的關鍵因素。然后，由類固醇激素急性調節蛋白（StAR） 介導甾體合成，從線粒體膜外向膜內轉運， 通過 P450膽固醇側鏈裂解酶（P450scc，由CYP11A1 基因表達） 催化，并合成睪酮［3］。

本實驗探索補腎益元方對運動性低血睪酮大鼠睪丸Leydig 細胞睪酮合成酶的影響，以方中臣藥淫羊藿提取物為陽性對照，觀察細胞超微結構及睪酮合成相關酶變化，探討該方對防治大鼠運動性低血睪酮的有效性和分子機制。

1 材料

SPF 級雄性SD 大鼠40 只（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），體質量（300±10） g，實驗動物生產許可證號SCXK（湘）2013-0004，溫度23 ～25 ℃，相對濕度40%～60%，每天光照時間5 h。H7700 透射電鏡（日本日立公司）；164-5050 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；DYCZ-40 A轉膜儀（北京六一生物科技有限公司）。Tris、APS、SDS、TEMED、Tween-20 等購自美國Sigma 公司。

淫羊藿提取物制備方法為取適量藥材粉末，用44%乙醇按液料比25 ∶1，在80 ℃水浴中浸提56 min，每5 min搖勻1 次，進行第1 次提取；第2 次提取時用44%乙醇按液料比20 ∶1，在80 ℃水浴中浸提40 min，合并2 次浸提液，回收乙醇，得到總黃酮質量濃度為3.5 mg／mL 的濃縮液，加蒸餾水稀釋成2.5 mg／mL，以1 mL／min 體積流量上樣。充分吸附后，先以2.5 BV10%乙醇洗脫除去極性大的雜質， 再以4 BV70%乙醇洗脫得總黃酮， 體積流量1.5 mL／min。總黃酮洗脫液回收乙醇后稀釋，以水-乙酸乙酯1 ∶2 的比例萃取5 次，每次10 min，合并乙酸乙酯相，即得。

補腎益元方由人參皂苷、淫羊藿苷、枸杞多糖，以及其他提取物（女貞子、黃芪、仙鶴草、大伸筋草、卷柏等） 組成，為褐色粉末，由該復方所制得膠囊的平均粒重為0.543 1 g，由西安天一生物技術股份有限公司制作并提供（批號201500139），具有補肝腎、強筋骨、補氣活血、祛風通絡功效。課題組前期通過HPLC 法，測得每粒膠囊中分別含人參總皂苷、淫羊藿苷43.57、5.03 mg。

2 方法

2.1 分組與給藥 40 只大鼠隨機分為空白組、模型組、淫羊藿提取物組及補腎益元方低、高劑量組，其中淫羊藿提取物組劑量為0.70 g／kg；補腎益元方低、高劑量組劑量分別為0.35、0.70 g／kg，復方用生理鹽水溶解后配成4 mL溶液，高劑量用量與成人持平［4］。給藥組大鼠運動前1 h灌胃給藥；空白組、模型組大鼠正常飲食，每天灌胃4 mL生理鹽水，連續6 周。

2.2 模型建立 采用逐級遞增負荷跑臺的方案建立大鼠運動性低血睪酮動物模型，以血睪酮較訓練前下降15%為判斷依據［5］。該方案是參照Bedford 在1979 年根據大鼠體質量／攝氧量回歸方程所建立的逐漸遞增速度和時間的運動訓練方式，周期6 周，每周訓練6 d，坡度保持在0°，最后1 d進行力竭運動。

2.3 取樣與指標檢測 大鼠6 周訓練結束后次日，腹腔注射2%戊巴比妥麻醉，腹主動脈血制備血清，置于-20 ℃冰箱中保存，用于測定血清皮質醇、睪酮水平；取大鼠外周血，半自動生化分析儀檢測血清總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-CE）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-CE） 水平；無菌環境下取大鼠雙側睪丸（盡量是同側同一部位）進行電鏡觀察，放入電鏡保存液；Percoll 梯度離心法分離制備睪丸Leydig 細胞，-80 ℃下冷凍保存，Western blot 法檢 測HMG-COA、 LDL-R、 SR-BI、 StAR、 CYP11A1 蛋 白表達。

2.4 統計學分析 通過SPSS 18.0 軟件進行處理，數據用表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 補腎益元方對睪酮、皮質醇、總膽固醇、HDL-CE、LDL-CE 水平的影響 表1 顯示，與空白組比較，模型組睪酮水平、睪酮／皮質醇顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，補腎益元方組兩者顯著升高（P＜0.01）。

表1 補腎益元方對睪酮、皮質醇、總膽固醇、HDL-CE、LDL-CE 水平的影響

表1 補腎益元方對睪酮、皮質醇、總膽固醇、HDL-CE、LDL-CE 水平的影響

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01

組別 （μ睪g·酮dL／-1） （皮μg·質d醇L-1／） 睪酮／皮質醇 （總mm膽o固l·L醇-1／） （m HmD L ol·-C L E-1／） （m LD m L ol-·CLE-／1）空模淫補補白型羊腎腎組組藿益益 提元元 取方方物低高組劑劑 量量 組組 11222 81012 75600.....05865 51306 08307±±±±±41551 83..4..50.30387 15741 034???? ###? ? 11111.....77777 54888 85726±±±±±00000.....32321 48216 34817 1111 06112 87994.....98532 23385 90207±±±±±31211 64534.....02007 08318 08799 #??##??? ? 10001.....09990 38988 70514±±±±±00000.....11011 04602 11870 22222.....22222 13210 83655±±±±±00000.....10011 68916 45818 00000.....55555 13223 31701±±±±±00000.....01100 93096 62523

3.2 補腎益元方對大鼠睪丸Leydig 細胞超微結構變化的影響 圖1 顯示，空白組大鼠睪丸細胞結構正常，少部分細胞輕微水腫，但細胞內線粒體結構、內質網清晰；模型組大鼠間質水腫嚴重，部分細胞水腫、壞死、內質網擴張，細胞膜破裂，少部分線粒體空泡變，染色質邊集、裸核；淫羊藿提取物組大鼠間質、部分細胞輕微水腫，細胞膜破裂；補腎益元方低劑量組大鼠部分細胞輕微水腫，少量線粒體體空泡變，溶酶體增多；補腎益元方高劑量組大鼠間質輕微水腫，部分間質細胞少量線粒體空泡，溶酶體增多，部分細胞染色質邊集，細胞結構和內質網可見。

圖1 各組大鼠睪丸間質細胞超細微結構

3.3 補 腎 益 元 方 對HMG-COA、 LDL-R、 SR-BI、 StAR、CYP11A1 蛋白表達的影響 表2、圖2 顯示，與空白組比較，模型組HMG-COA、StAR、CYP11A1 蛋白表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）：與模型組比較，補腎益元方組三者蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。

4 討論

4.1 大鼠睪丸Leydig 細胞超微結構改變 在大鼠睪丸Leydig 細胞的線粒體和內質網中，含有合成睪酮的一系列關鍵酶，如催化膽固醇合成睪酮2 個最重要的限速酶P450scc、StAR，故兩者在細胞合成和分泌睪酮中起到重要

表2 補腎益元方對HMG-CoA、LDL-R、SR-BI、StAR、CYP11A1 蛋白表達的影響

表2 補腎益元方對HMG-CoA、LDL-R、SR-BI、StAR、CYP11A1 蛋白表達的影響

組別 HMG-CoA LDL-R SR-BI STAR CYP11A1空模淫補補白型羊腎腎組組藿益益 提元元 取方方物低高組劑劑 量量 組組 00000.....43444 12579±±±±±00000.....00000 13111 39929 #?###??? ?? 00000.....44434 58291±±±±±00000.....00000 36332 57185 00000.....33333 73223±±±±±00000.....00000 34223 52892 00000.....33444 83262±±±±±00000.....00000 21123 17892 #?#? ???? 00000.....43445 58161±±±±±00000.....00000 21221 24125#△??#? ?△

圖2 各 組 HMG-COA、 LDL-R、 SR-BI、 STAR、CYP11A1 蛋白表達灰度

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01；與補腎益元方高劑量組比較，△△P＜0.01作用［6-7］。李維仁等［8］通過電鏡觀察老年人睪丸Leydig 細胞，發現部分線粒體水腫，脂滴含有量降低，可能與睪酮降低緊密相關；也有人認為，睪酮水平下降是由于睪丸Leydig 細胞數量的減少［9］；朱寶安、Luo 等［10-11］報道，睪丸Leydig 細胞過度凋亡造成睪酮分泌明顯下降。

本實驗發現，大強度運動對大鼠睪丸超微結構造成明顯破壞，尤其是模型組出現間質細胞水腫、壞死，部分細胞膜破裂、內質網擴張，染色質出現邊集、裸核、細胞核固縮等現象，表明細胞損傷必然會影響睪酮合成及分泌，與鄭菁等［12］報道基本一致；補腎益元方干預后，睪丸Leydig 細胞的水腫狀況得到改善，內質網、線粒體、溶酶體結構大致清晰可見，表明該方通過保護和修復細胞內質網及線粒體結構來維持其正常功能，從而促進睪酮的分泌，與石幼琪等［13］研究結果十分接近。

4.2 大鼠睪丸Leydig 細胞膽固醇合成限速酶HMG-CoA、LDL-R、SR-BI 蛋白表達 HMG-CoA 還原酶催化HMG-CoA轉變成甲基二羥基戊酸，是膽固醇內源性合成過程限速酶，其活性高低直接決定血漿膽固醇的水平［14］。嚴翊等［15］比較5 周間歇性負重游泳訓練和多增加1 周訓練，發現兩者血睪酮明顯降低，但5 周未出現睪丸Leydig 細胞HMG-CoA還原酶基因表達變化，而增加1 周后其表達顯著降低，這與本實驗結果基本一致，可能是運動造成血睪酮降低，從而抑制細胞HMG-CoA 還原酶基因表達。本實驗發現，給藥組HMG-CoA 還原酶蛋白表達明顯高于空白組、模型組，但不同劑量之間無明顯差異，表明淫羊藿提取物、補腎益元方有助于睪丸Leydig 細胞內膽固醇生物合成，從而提高大鼠睪酮分泌，但這與紀綱［16］研究結果恰好相反。

睪丸Leydig 細胞可分別通過LDL-R 介導的內吞作用和／或SR-BI 介導的膽固醇選擇性吸收途徑來攝取血液中膽固醇，其主要功能是通過攝取LDL-CE 進入細胞內，產生游離膽固醇，并且LDL-R 合成速度及活性與細胞內膽固醇含有量呈反比［17］，研究表明，有氧運動可在轉錄水平上調大鼠肝臟LDL-R 基因表達，通過增加細胞內膽固醇的利用或降解影響LDL-R 合成，增加肝臟攝取，從而改善血脂水平，預防高脂飲食引起的LDL 代謝異常［18］； SR-BI 是HDL-CE 的高親和力受體，也是膽固醇流出與流入的重要載體，主要介導血漿膽固醇逆向轉運回肝臟和類固醇激素生成組織進行代謝的過程［19］。本實驗發現，與空白組比較，模型組血清睪酮明顯降低時大鼠睪丸Leydig 細胞LDLR 蛋白表達略微增加，但不明顯，與張勇等［20］報道一致；給藥組血清睪酮明顯升高時，該蛋白表達略微降低，但不明顯，表明給藥后可能HMG-CoA 還原酶主導的細胞內膽固醇生物合成增加，從而使LDL-R 轉錄攝取外源性膽固醇的通路受到抑制；與空白組比較，給藥組SR-BI 蛋白表達均有所下降，但不明顯，血清總膽固醇、LDL-CE、HDLCE 水平亦然，與田振軍［21］、嚴翊［15］報道一致，提示由SR-BI 介導的逆轉運攝取外源性膽固醇通路發生了障礙，而且血清膽固醇變化可能與運動訓練的時間、強度、方式有關。

當睪丸Leydig 細胞內睪酮水平降低時，可能首先通過HMG-CoA 還原酶主導膽固醇生物合成，其次是刺激LDL-R的轉錄，然后是SR-BI 介導逆轉運攝入外源性膽固醇，但三者之間膽固醇生成順序還有待進一步研究。見圖3。

圖3 睪丸Leydig 細胞內膽固醇來源

4.3 大鼠睪丸Leydig 細胞睪酮合成限速酶CYP11A1、StAR 蛋白表達 正常生理條件下，間質細胞內睪酮合成的第一步是由StAR 介導甾體合成的限速步驟——將膽固醇從線粒體膜外向膜內轉運，然后P450scc（由CYP11A1 基因表達） 對線粒體內基質膜內表面上的膽固醇催化生成孕烯醇酮，最終合成睪酮［22］。CYP11A1、StAR 蛋白表達高低及活性與睪酮生成顯著相關［23］， Wang 等［24］發現兩者mRNA 表達在45 d 達到最大值，此階段可能是睪酮合成的快速時期；管永波等［25］用氟化鈉抑制兩者mRNA 表達，首先影響孕酮合成，從而影響睪酮合成，致使雄性心生殖系統出現損傷；景曉平等［26］報道，雷公藤多苷可使幼年大鼠睪酮水平明顯降低，睪丸組織CYP11A1 蛋白表達下降，而補腎類中藥可提高雄鼠睪酮水平，從而保護生殖損傷。本實驗發現，模型組CYP11A1、StAR 蛋白表達較空白組明顯降低，表明它們與睪酮生成高低呈顯著正相關，與Zhao等［27］實驗結果一致；補腎益元方組睪丸Leydig 細胞兩者蛋白表達明顯增加，并高于淫羊藿提取物組，表明該方能提高兩者活性，從而促進膽固醇合成睪酮，與王建明等［28］報道一致。

補腎益元方可能通過睪丸Leydig 細胞內膽固醇內源性合成以及合成睪酮來影響血睪酮濃度，但對由LDL-R 轉錄和／或SR-BI 介導的逆轉運影響膽固醇合成的分子機制尚不明確，還需要進一步探討。