復(fù)方芩柏顆粒劑對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中RORγt、Foxp3 表達(dá)的影響

李克亞， 王真權(quán)?， 張佳敏

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肛腸三科，湖南 長(zhǎng)沙410005；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208）

潰瘍性結(jié)腸炎是一種原因不明的慢性直腸和結(jié)腸炎性疾病，其發(fā)病率逐年提高，但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)其病因、病理機(jī)制尚不明確，導(dǎo)致臨床治療缺乏特異性［1-3］。中醫(yī)藥治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床報(bào)道很多，均有一定療效，但對(duì)其作用機(jī)理的探討還不夠深入，難以系統(tǒng)的現(xiàn)代科學(xué)和微觀角度解釋闡述，從而使其可信度不足，難以向社會(huì)推廣［4-6］。

大多數(shù)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病與中醫(yī)“濕熱” “氣滯” “血瘀” 等病機(jī)有關(guān)［7］，在此思路的啟發(fā)下，課題組前期對(duì)古方止痛如神湯進(jìn)行化裁，用具有清熱利濕、行氣止痛、化瘀止血功效的復(fù)方芩柏顆粒劑保留灌腸治療；本實(shí)驗(yàn)基于前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及十多年臨床研究，研究該制劑對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中RORγt、Foxp3 表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制提供依據(jù)［8］。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠，雌雄各半，60 只，體質(zhì)量（220±10） g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京） 2016-0011，動(dòng)物質(zhì)量合格證11400700254258，適應(yīng)性喂養(yǎng)2～3 d。

1.2 模型建立［9］大鼠造模前禁食不禁水24 h，5%TNBS與無(wú)水乙醇按1 ∶1 體積配制成混合液。實(shí)驗(yàn)時(shí)腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL／kg） 麻醉大鼠，將一直徑2.0 mm、長(zhǎng)約12 cm 的硅膠管用石蠟油潤(rùn)滑，由肛門處輕緩插入大鼠體內(nèi)約8 cm，按100 mg／kg 劑量對(duì)正常對(duì)照組、造模組大鼠分別緩慢注入生理鹽水、混合液，提起尾部持續(xù)倒置10 min 以使造模劑充分滲入腸腔內(nèi)，仰臥歸籠，保溫?zé)粽丈渲链笫笞匀惶K醒，自由飲食。實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)抽取10 只造模大鼠，頸椎脫臼法處死后取其結(jié)腸組織，病理檢查確認(rèn)有充血、水腫、潰瘍形成等潰瘍性結(jié)腸炎典型病理變化時(shí)可認(rèn)為造模成功。

1.3 試藥及儀器 復(fù)方芩柏顆粒劑（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肛腸科自制）。HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。ELISA 試劑盒、DAB 顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；Trizol 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（A3500）、qPCR mix （A6001） （美國(guó)Promega 公司）；RORγt、Foxp3、β-actin 引物［生工生物工程（上海） 股份有限公司］；RIPA 蛋白裂解液（CW2334S）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（CW0014S）、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（CW0022） （北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；彩色預(yù)染蛋白Marker（加拿大Fermentas 公司）；ECL 發(fā)光檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher 公司，35055）；RORγt 抗體（bs-10647R）、Foxp3 抗體（bs-0269R） （北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；β-actin 抗體 （英國(guó)Abcam 公司，ab8227）；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠二抗（SA00001-1）、HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗（SA00001-2） （武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 正常對(duì)照組、模型組、美沙拉嗪組于造模2 周后開(kāi)始分別以蒸餾水、5%美沙拉嗪混懸液各2 mL灌腸，復(fù)方芩柏顆粒劑低、 中、 高劑量組分別以6%、12%、24%藥物混懸液各2 mL 灌腸。各組每天給藥2 次，連續(xù)3 周。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 一般情況 每天稱取大鼠體質(zhì)量，觀察大便性狀，檢測(cè)便潛血，評(píng)估疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI），公式為DAI=體質(zhì)量下降指數(shù)+大便性狀+大便潛血。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 DAI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.2.2 血清TGF-β1、IL-17 水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血，2 500 r／min 離心10 min，收集血清液，置-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫珽LISA 法檢測(cè)TGF-β1、IL-17水平。

2.2.3 結(jié)腸組織病理觀察 選取大鼠結(jié)腸病變區(qū)組織，10%中性甲醛固定，梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，間斷連續(xù)切5 μm 厚片，HE 染色，脫水，透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理改變。

2.2.4 結(jié)腸組織中RORγt、Foxp3 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Westren-blot 法。取大鼠結(jié)腸組織，于液氮中研磨至粉末狀，提取組織總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白量，取50 μg 上樣，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉處理1 h，加入一抗RORγt、Foxp3、β-actin（1 ∶1000） 孵育過(guò)夜，二抗（1 ∶3 000） 室溫孵育1 h，暗室加ECL 化學(xué)發(fā)光劑于化學(xué)發(fā)光儀成像，IPP6.0 圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行信號(hào)分析，計(jì)算目的蛋白／β-actin 蛋白比值。

2.2.5 結(jié)腸組織中RORγt、Foxp3 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR 法。Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度后將1 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板采用熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，操作均按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。qPCR 反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，循環(huán)40 次，以βactin 為內(nèi)標(biāo)，2-ΔΔCt法計(jì)算RORγt、Foxp3 相對(duì)表達(dá)，引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，序列見(jiàn)表2。

表2 PCR 引物序列

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，而多組間比較前先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用One-Way ANOVA 檢驗(yàn)，LSD 法進(jìn)行多重比較；方差不齊時(shí)采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，先用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)比較總差異，再用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)進(jìn)行2 組間比較。另外，計(jì)數(shù)資料采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多樣本比較的秩和檢驗(yàn)。。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方芩柏顆粒劑對(duì)大鼠一般情況的影響 正常對(duì)照組大鼠反應(yīng)靈活，皮毛濃密有光澤，飲食正常，大便成形呈褐色，活動(dòng)無(wú)明顯異常改變；模型組大鼠精神萎靡，皮毛易脫落，輕微豎毛，食量減少，便質(zhì)軟，有少量黏液或伴有血便，體重減輕；給藥組大較模型組有不同程度的改善。圖1 顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠DAI 評(píng)分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，復(fù)方芩柏顆粒劑組該評(píng)分顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 各組大鼠DAI 評(píng)分

3.2 復(fù)方芩柏顆粒劑對(duì)TGF-β1、IL-17 水平的影響 圖2顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組TGF-β1 水平顯著降低（P＜0.01），IL-17 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，復(fù)方芩柏顆粒劑高、中劑量組前者水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），后者水平顯著降低（P＜0.01），并呈一定量效關(guān)系。

3.3 復(fù)方芩柏顆粒劑對(duì)大鼠結(jié)腸組織病理變化的影響 肉眼顯示，正常對(duì)照組大鼠結(jié)腸紋理清晰，無(wú)損傷；模型組大鼠結(jié)腸黏膜表面輕度充血、水腫，糜爛較局限，偶可見(jiàn)針尖樣潰瘍。光鏡下（圖3） 顯示，正常對(duì)照組大鼠結(jié)腸各層組織結(jié)構(gòu)完整清晰，腺體排列整齊，未見(jiàn)水腫、潰瘍形成；模型組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，部分區(qū)域黏膜脫落，腺體稀疏或缺失，排列紊亂，充血明顯，并有局灶性出血，細(xì)胞間質(zhì)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)廣泛，偶可見(jiàn)潰瘍深達(dá)肌層；給藥組大鼠實(shí)施情況均有不同程度的減輕，部分黏膜有淺表覆蓋，輕度水腫，另一部分有肉芽組織增生，形成瘢痕。

3.4 復(fù)方芩柏顆粒劑對(duì)RORγt、 Foxp3 蛋白表達(dá)的影響 圖4 顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組RORγt 蛋白表達(dá)顯著升高（P ＜0.01），F(xiàn)oxp3 蛋白表達(dá)顯著降低（P ＜0.01），兩者比值明顯失衡；與模型組比較，復(fù)方芩柏顆粒劑組前者蛋白表達(dá)（除低劑量組外） 顯著降低（P＜0.01），后者蛋白表達(dá)及兩者比值顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），并呈一定量效關(guān)系。

圖2 各組TGF-β1、IL-17 水平

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織病理變化（HE 染色，×100）

3.5 復(fù)方芩柏顆粒劑對(duì)RORγt、Foxp3 mRNA 表達(dá)的影響 圖5 顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組RORγt mRNA表達(dá)顯著升高 （P ＜0.01），F(xiàn)oxp3 mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，復(fù)方芩柏顆粒劑組前者mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01），后者mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），并呈一定量效關(guān)系。

4 討論

IL-17 是新近發(fā)現(xiàn)的一種重要的促炎癥細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的促炎反應(yīng)活性，可通過(guò)增加細(xì)胞的通透性來(lái)促進(jìn)其他前炎癥因子和趨化因子產(chǎn)生，當(dāng)它與受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)活化T 細(xì)胞和刺激成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎介質(zhì)（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、一氧化氮合酶2、單核細(xì)胞趨化蛋白-1 等），并通過(guò)聯(lián)系體內(nèi)適應(yīng)免疫系統(tǒng)和固有免疫系統(tǒng)，介導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎等免疫疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程［10-12］。TGF-β1 可由多種白細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生，是重要的免疫調(diào)節(jié)分子，能通過(guò)調(diào)節(jié)特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 表達(dá)來(lái)影響Treg 細(xì)胞分化，并與維持外周Treg 細(xì)胞發(fā)育及功能活性密切相關(guān)，是誘導(dǎo)Treg 細(xì)胞生成所必需的，當(dāng)外周淋巴器官中該信號(hào)受損時(shí)，F(xiàn)oxp3 表達(dá)減少，Treg 抑制功能減弱，最終導(dǎo)致自身免疫綜合征［13-14］。目前認(rèn)為，RORγt 和Foxp3 分別是控制Thl7／Treg 細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，其中前者在Thl7 細(xì)胞分化過(guò)程中呈持續(xù)表達(dá)狀態(tài)，并控制IL-17 表達(dá)過(guò)程；后者在CD4+CD25+Treg細(xì)胞分化過(guò)程中呈特異性高表達(dá)，可調(diào)控Treg 細(xì)胞分化發(fā)育和功能，該基因突變或敲除小鼠會(huì)導(dǎo)致CD4+CD25+Treg細(xì)胞缺失或下降，伴有功能缺陷，誘發(fā)嚴(yán)重自身免疫反應(yīng)［15-16］。

圖4 各組RORγt、Foxp3 蛋白表達(dá)

圖5 各組RORγt、Foxp3 mRNA 表達(dá)

復(fù)方芩柏顆粒劑及其制備工藝已于2000 年獲得中華人民共和國(guó)國(guó)家知識(shí)專利（專利號(hào)ZL941131149），是在古方止痛如神湯的基礎(chǔ)上進(jìn)行化裁，主要由黃芩、黃柏、秦艽、桃仁、防風(fēng)、澤瀉、當(dāng)歸、制大黃、玄胡、生地、檳榔11味中藥組成，方中黃芩、黃柏清熱燥濕；大黃瀉火解毒，活血祛瘀；當(dāng)歸、生地補(bǔ)血活血；桃仁活血祛瘀；玄胡、檳榔活血行氣止痛；防風(fēng)、秦艽勝濕止痛；澤瀉清熱利濕，諸藥合用，補(bǔ)瀉并舉，瀉中有補(bǔ)，共奏清熱利濕、行氣止痛、化瘀止血之功效，主治與“濕熱” “氣滯” “血瘀” 等病機(jī)有關(guān)的疾病。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方芩柏顆粒劑能在一定程度上改善潰瘍性結(jié)腸炎大鼠癥狀，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)TGF-β1 表達(dá)，調(diào)控RORγt、Foxp3 的平衡，進(jìn)而下調(diào)IL-17 表達(dá)，從而改善炎癥，并呈一定劑量關(guān)系，為其臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但該方對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的作用靶點(diǎn)是否是多途徑的尚不明確，還需要作進(jìn)一步研究。