甘草地上部分對慢性前列腺炎大鼠的影響

張 琳， 趙梓邯， 于冰莉， 崔 潔， 侯俊玲，3?， 王文全，3

（1.北京中醫藥大學中藥學院，北京100102；2.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京100193；3.中藥材規范化生產教育部工程研究中心，北京100102）

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根莖［1］，用藥歷史悠久，市場需求量大，但一直以來大量地上部分未得到有效利用而廢棄，造成資源浪費。研究表明，甘草地上部分中黃酮類成分含有量高，并有較好的藥理活性，已從中分離得到61 個黃酮類化合物和7 個酚類化合物［2］；地上、地下部分中黃酮類成分HPLC指紋圖譜差異很大，以前者葉中含有量更高［3］；該部分中黃酮類成分具有良好的抗氧化及抗炎活性［4］，尤其對前列腺炎有較顯著的預防和治療作用［5］。

前列腺炎是最常見的泌尿生殖系統疾病，會導致排尿不暢、尿液潴留、性功能障礙等癥狀，流行病學調查顯示，慢性前列腺炎／慢性骨盆疼痛綜合征在男性人群中的發病率高達2.5%～16%［6］，其病情大多與久坐、疲勞、禁欲縱欲、吸煙飲酒等多種因素有關?，F代醫學對慢性前列腺炎的發病機制存在廣泛爭議，多數學者認為可能是病原體感染、炎癥、異常的盆底神經肌肉活動和免疫異常等共同作用的結果［7］，導致相關治療十分困難。

本實驗以甘草地上部分為研究對象，考察它對慢性前列腺炎大鼠的影響，既為前列腺炎臨床治療提供新的天然藥物，又為甘草綜合開發利用奠定理論基礎。

1 材料

1.1 動物 清潔級健康雄性SD 大鼠40 只，體質量280 g左右，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，常規飼養，每天自由飲水進食， 動物合格證號SCXK （京）2016-0006。

1.2 試藥 甘草地上部分于2016 年9 月采自甘肅省酒泉市瓜州縣河東鄉，經北京中醫藥大學王文全教授鑒定為甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的地上部分。前列康（浙江康恩貝制藥股份有限公司）；槲皮素（上海源葉生物科技有限公司）；角叉菜膠（北京索萊寶科技有限公司）；水合氯醛、羧甲基纖維素鈉（天津市福晨化學試劑廠）；ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 儀器 FA2 004 N 型分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；Multiskan FC 型酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）；RE-52 型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB型循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；101-2AB 型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；KH-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZN-02 型粉碎機（北京興時利和科技發展有限公司）；移液槍（德國Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1.1 甘草水提物 甘草地上部分打粉，以1 ∶10 料液比用去離子水煎煮2 次，每次1.5 h，趁熱過濾，濃縮濾液，55 ℃下烘干，即得，4 ℃下保存備用。

2.1.2 甘草醇提物 按照課題組前期所得最佳工藝進行提取，并稍作調整。條件為70%乙醇，料液比1 ∶10，70 ℃下超聲提取20 min，濃縮濾液，55 ℃烘干，即得，4 ℃下保存備用。

2.2 分組、造模與給藥 40 只大鼠隨機分為假手術組、模型組、水提組、醇提組、陽性組，每組8 只，適應性喂養1 周后在無菌條件下以10%水合氯醛麻醉，腹正中切口至腹腔，提出膀胱及兩側精囊。除假手術組大鼠注射等量生理鹽水外，其余各組前列腺腹側葉注入0.1 mL 角叉菜膠生理鹽水溶液，注射后縫合肌肉、皮膚［8-9］。水提組大鼠灌胃給予1 g／kg 藥物CMC-Na 溶液，醇提組大鼠灌胃給予1 g／kg藥物CMC-Na 溶液，陽性組大鼠灌胃給予0.552 g／kg前列康CMC-Na 溶液，假手術組、模型組大鼠灌胃給予20 mL／kg 0.7%CMC-Na 溶液，每天1 次，連續30 d。

2.3 取樣及指標檢測 末次給藥24 h 后麻醉大鼠，腹主動脈取血，處死，取前列腺、胸腺，吸干臟器表面液體和血液，稱定質量并記錄，計算臟器指數，并進行相關檢測。2.3.1 血清PGE2、MCP-1、NF-κB 表達 血樣放置4 h 后離心15 min，取血清，ELISA 試劑盒檢測PGE2、MCP-1、NF-κB 表達。

2.3.2 前列腺組織病理變化 取出部分大鼠前列腺組織，10%甲醛溶液固定， 常規石蠟包埋切片， 進行HE、Masson、免疫組化染色，鏡檢觀察其病理變化。

2.3.2.1 HE 染色［10］按照各給藥組前列腺腺體組織病變程度，將其形態學變化分為3 個等級進行定量評價，對各項病理變化評分計算總和作為整體評分。主要從腺體形態、炎性細胞浸潤、纖維組織增生程度3 個方面進行評價，評分標準如下。

腺體形態：腺上皮單層細胞結構完整，排列整齊，細胞呈柱狀、立方形，腺體上皮向管腔內折疊形成皺襞——2分；腺上皮輕度增生，有損傷，腺體上皮皺襞減少——4分；腺上皮受損變形嚴重，腺上皮皺襞減少或無——6 分。

瑞安嘆息了一聲，用一只手拽起頭發。“好吧，我明白了。只是要答應我，假如外星人打過來了，你會脫身后再來找我?！?/p>

炎癥表現情況及炎性細胞浸潤程度：腺腔偶見炎性細胞——2 分；腺腔中度炎性細胞浸潤——4 分；腺腔充滿炎性細胞，且伴有充血現象——6 分。

纖維組織增生程度：極少纖維組織增生——2 分；纖維組織增生程度較輕——4 分；腺體周圍有大量纖維組織增生，包被腺體——6 分。

2.3.2.2 Masson 染色 通過Image-pro Plus 軟件進行定量分析，通過計算陽性表達區域的光密度值來綜合評價各組纖維組織增生情況。

2.3.2.3 免疫組化染色 通過Image-pro Plus 軟件進行半定量分析，以平均光密度為指標評價大鼠前列腺組織中TNF-α 表達。

2.4 統計學分析 通過SAS 8.2 軟件進行處理，組間比較采用方差分析。P＜0.05 表示有顯著性差異。

3 結果

3.1 大鼠一般狀況和解剖體征 圖1 顯示，給藥期間大鼠體質量增長趨勢一致，組間均無顯著性差異（P＞0.05）；第2 周開始，模型組大鼠體質量增加程度略低于假手術組，可能是疾病給大鼠帶來一定痛苦，導致其食欲降低，體質量增長稍慢。

圖1 各組大鼠體質量變化

圖2 顯示，假手術組大鼠前列腺表面紅潤有光澤，腺體組織柔軟且有彈性；模型組大鼠腺體發紅、腫大；給藥組大鼠腺體紅腫現象均有一定程度改善，但水提組有3 只出現肝病變，其中1 只左側腹腔出現瘤狀物，醇提組有1只大鼠出現肝病變。

圖2 各組大鼠解剖體征病變

3.2 臟器指數 圖3 顯示，模型組大鼠前列腺指數略高于假手術組，但各組之間無顯著性差異（P＞0.05），水提組相對較低；模型組大鼠胸腺指數顯著高于假手術組（P＜0.05），各給藥組均有不同程度的降低，以水提組、醇提組更明顯（P＜0.05），表明水提物和醇提物能有效降低胸腺指數。

3.3 MCP-1、NF-κB、PGE2 表達 圖4 顯示，模型組MCP-1、NF-κB、PGE2 表達顯著高于假手術組（P＜0.05）；各給藥組MCP-1 表達均有降低趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）；各給藥組NF-κB 表達顯著降低（P＜0.05），以水提組更明顯；水提組、陽性組PGE2 表達顯著降低（P＜0.05）。

3.4 大鼠前列腺組織病理形態 圖5 ～6 顯示，假手術組大鼠前列腺組織腺體完整，腺上皮單層細胞結構完整，未見萎縮，細胞間質炎性細胞少，無纖維組織增生情況，腺腔內分泌物豐富；模型組大鼠前列腺腺體變形嚴重，腺體萎縮，腺上皮皺襞減少，有脫落、壞死現象，部分腺上皮呈乳頭狀增生，腺體間質炎性細胞浸潤嚴重，有明顯的水腫現象，腺腔內分泌物減少；陽性藥組大鼠腺體變形有所改善，腺體間質炎性細胞浸潤較模型組減輕，部分腺腔內無分泌物；水提組大鼠前列腺組織腺體完整，上皮細胞排列較為整齊，間質水腫明顯減輕，炎癥細胞和分泌物明顯減少；醇提組大鼠前列腺組織完整，但仍可見前列腺腺體稍有變形，部分炎性細胞浸潤嚴重，改善情況不如水提物組。

圖3 各組大鼠前列腺（A）、胸腺（B） 指數

圖4 各組MCP-1（A）、NF-κB（B）、PGE2（C） 表達

圖5 各組大鼠前列腺組織病理形態（HE 染色，×200）

圖6 各組大鼠前列腺組織病理評分

圖7 顯示，模型組大鼠前列腺組織纖維化程度高于假手術組，而甘草水提物組、醇提物組、陽性組大鼠有一定程度的緩解。

圖7 各組大鼠前列腺組織病理形態（Masson 染色，×400）

3.5 TNF-α 表達 圖8 顯示，假手術組大鼠基本無陽性表達；模型組大鼠細胞質、腺上皮細胞中存在大面積陽性表達；水提組大鼠TNF-α 表達較模型組有很大程度減少，并且優于醇提組；醇提組大鼠TNF-α 表達較模型組稍有減少；陽性組大鼠與假手術組接近。圖9 顯示，模型組TNF-α 表達顯著高于假手術組（P＜0.05），各給藥組均能顯著降低其表達（P＜0.05），并且水提物組優于醇提物組。

圖8 各組TNF-α 表達（免疫組化染色，×400）

圖9 各組TNF-α 表達

4 討論

目前對慢性前列腺炎發病機制尚未明確［11］，國內外有多種建模方法，而本實驗采用注射角叉菜膠溶液。結果顯示，模型組MCP-1、NF-κB、PGE2 表達明顯提高，腺體變形嚴重，腺上皮有脫落、壞死現象，腺體間質炎性細胞浸潤嚴重，有明顯的水腫、纖維化現象，表明模型建立成功。

MCP-1 是一種重要的單核細胞激活因子，可誘導炎癥因子的表達，在多種炎癥疾病評價中有重要參考價值；NFκB 是細胞胞漿中的反應轉錄因子，參與炎癥中的免疫反應，其表達可引發多種炎癥介質的產生，從而使炎癥反應加劇；PGE2 在炎癥過程中有致熱作用，也可引發水腫，而炎癥和水腫是導致前列腺炎患者尿路刺激癥產生的主要原因之一；TNF-α 是重要的炎癥因子，能誘導趨化因子產生，使上皮細胞和淋巴細胞表達黏附分子，導致組織細胞增生、組織損傷等病理變化［11］。本實驗發現，甘草地上部分醇提物能明顯降低血清NF-κB 表達，而水提物能明顯降低NFκB、PGE2 表達，并在一定程度上降低前列腺組織中TNF-α表達，減輕炎性細胞浸潤及纖維組織增生情況，并且效果優于醇提物。

綜上所述，甘草地上部分水提物有較好的抗前列腺炎作用，但本實驗發現部分大鼠出現肝病變，其潛在毒性有待進一步確認。因此，今后將對甘草地上部分進行系統的毒理學研究和安全性評價，為其資源合理開發利用提供理論指導。