艾司唑侖聯合黃連阿膠湯加減對腦卒中后失眠血虧陰虛證大鼠的影響

張紅艷， 池發斌， 張 寧， 許素燕， 王愛鳳?

（1.阜外華中心血管病醫院河南省人民醫院心臟中心藥學部，河南鄭州450000；2.河南省人民醫院藥學部，河南 鄭州450003）

1 材料

1.1 動物 SPF 級健康雄性Wistar 大鼠75 只，體質量（210±20） g，由河南中醫藥大學科研實驗動物中心提供，實驗動物生產證號SYXK（豫）2012-00009，分籠飼養。實驗前3 d 適應環境，自由飲水，自然光照，室溫 （20±2）℃。

1.2 試藥 黃連阿膠湯加減由免煎中藥顆粒生地、當歸各20 g，黃連、黃芩各12 g，黃芪、阿膠各9 g，白芍6 g（江陰天江藥業有限公司） 組成。艾司唑侖片（四川大冢制藥有限公司，批號H20170205）。5-HT、5-HIAA 酶聯免疫試劑盒購自上海賽默生物科技發展有限公司；NA、DA 酶聯免疫試劑盒購自美國R＆D 公司；PBS 緩沖液、DAB 顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；RIPA 裂解液、PMSF、蛋白上樣緩沖液購自蘭州晟威生物科技有限公司。1.3 儀器 BS110S 型電子天平購自德國賽多利斯公司；XJ80-2 型醫用離心機購自金壇市恒豐儀器廠；ND-97 型數字化腦電圖儀購自上海醫療器械高技術公司；56100 型大鼠腦立體定位儀購自美國Stoelting 公司；TSJ-II 型全自動封閉式組織脫水機購自常州市中威電子儀器有限公司；7230G 型分光光度計購自上海精密儀器儀表有限公司；MT-360 型液體快速混合器購自常州德杜精密儀器有限公司；043BR38725 型電泳儀購自新加坡ESCO 公司；1305529 型轉膜儀、1124003 型凝膠拍照儀購自北京賽百奧科技有限公司；PVDF 膜，購自蘭州晟威生物科技有限公司；HH-702 型超級恒溫水浴鍋購自北京晨曦勇創科技有限公司。手術器械、縫合針由河南中醫藥大學科研實驗中心提供。

2方法

2.1 造模

2.1.1 腦卒中模型 參照Koizumi［5］報道的方法建立，并加以改良。大鼠仰臥位固定，頸部備皮，消毒，注射3%戊巴比妥鈉（45 mg／kg） 麻醉，頸部正中切口，逐層分離組織以充分暴露右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，同時分離迷走神經以免誤傷而出現呼吸驟停，結扎頸總動脈近心端及頸外動脈根部，備線打一活結，動脈夾夾閉遠心端，于分叉處下方剪一斜行切口，將備好的漁線從切口處插入，輕輕旋轉，由切口處進入約（18.5±0.5） mm，有阻力感時停止推進，此時已阻斷了大腦中動脈入口，然后立即備線結扎，固定線栓以防止出血，撤去動脈夾，縫合傷口，消毒，漁線暴露在皮膚之外，2 h 后拔出漁線；空白組漁線插入僅10 mm，其余步驟同上。再灌注48 h 后將大鼠處死，留取標本待測，造模后24 h 參照Zea Longa［6］報道的方法進行神經系統功能評分。

2.1.2 失眠血虧陰虛證模型 在腦卒中模型基礎上參照游秋云等［7］報道的方法建立。 大鼠腹腔注射環磷酰胺（100 mg／kg） 制備血虧模型，同時腹腔注射氫化可的松（50 mg／kg） 制備陰虛證模型。

2.2 分組與給藥 75 只大鼠按體質量隨機分為空白組、模型組、聯合組［艾司唑侖（2 mg／kg） +黃連阿膠湯加減（18.0 g／kg） ］、艾司唑侖組（2 mg／kg）、黃連阿膠湯加減組（18.0 g／kg），每組15 只，剔除死亡和不符合納入標準者，每組隨機取10 只。給藥組大鼠按5 mL／kg 劑量灌胃給藥，空白組、模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，1 次／d，連續14 d。

2.3 指標檢測

2.3.1 睡眠時相［8］大鼠覺醒-睡眠周期包括Wake 期、SWS1 期、SWS2 期、REMS 期，TST=SWS1 期+SWS2 期+REMS 期。規定每一個獨立的睡眠時相持續時間＞20 s，并將20 s 作為一個睡眠時相的分析單元。

本研究的結果可以為海洋溢油的微生物修復提供優良菌源和基礎數據。但論文中很多的研究工作還處于初始階段，未來應進一步深化研究。

2.3.2 腦干和下丘腦中GAD、GS 蛋白表達［9］采用免疫印跡進行測定。

2.3.2.1 樣本制備 脫頸椎處死大鼠，取腦組織，稱定質量后剪碎，加入RIPA 裂解液和PMSF，勻漿、超聲（消耗功率160 W，加熱功率260 W，頻率59 kHz）15 min，4 ℃離心（12 000 r／min）10 min，取上清液，作為總蛋白。雙光束紫外可見分光光度計進行蛋白定量（嚴格按照儀器操作說明），加入蛋白上樣緩沖液。

2.3.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 10%丙烯酰胺配置分離膠后，移至兩層玻璃板之間進行膠凝，3.9%丙烯酰胺配置濃縮膠，灌注，封口，膠凝，膠板置于電泳槽中，倒入電泳緩沖液，加入樣品和Maker，當目標條帶跑到分離膠底部時停止電泳，取膠。

2.3.2.3 轉膜 依據凝膠大小剪下濾紙和PVDF 膜，按順序放好濾紙、PVDF 膜、凝膠，連接電極，100 V 下轉移1 h。

2.3.2.4 封閉 轉膜后取PVDF 膜，置于封閉液中封閉3 h，然后放入一抗、二抗，室溫下分別孵育2 h。

2.3.2.5 顯色 在膜上滴顯色AB 液，即刻放到凝膠成像系統拍照。

2.3.3 下丘腦中神經遞質水平［10］取大鼠全腦組織，冰冷生理鹽水除去腦膜血管，冰冷平皿中分離下丘腦，稱定質量，加入正丁醇，在玻璃勻漿器中勻漿，離心（3 000 r／min）5 min，吸取上清液2 mL，加入pH 6.5 磷酸鹽緩沖液，搖勻，與氧化碘試劑行反應，測定下丘腦中5-HT、NA、5-HIAA、DA 吸光度，繪制標準曲線，換算成其水平。

2.3.4 血漿中神經遞質水平 處死大鼠后取腹主動脈血5 mL，加肝素抗凝，離心（3 000 r／min） 10 min，嚴格按照酶聯免疫試劑盒操作測定血漿中5-HT、NA、5-HIAA、DA 水平。

2.4 統計學分析 通過SPSS16.0 軟件進行處理，計量資料以表示，多組間比較用單因素方差分析，2 組間比較采用t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 對大鼠睡眠時相的影響 表1 顯示，與空白組比較，模型組SWS1、SWS2、REMS、TST 顯著縮短（P＜0.05）；與模 型 組 比 較， 聯 合 組、 艾 司 唑 侖 組SWS1、 SWS2、REMS、TST 顯著延長 （P ＜0.05），黃連阿膠湯加減組SWS2、REMS 顯著延長（P＜0.05）。

表1 對大鼠睡眠時相的影響

表1 對大鼠睡眠時相的影響

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量／（g·kg-1） Wake／sSWS1／sSWS2／s REMS／s TST／s空模聯艾黃白型合司連組組組唑阿 侖膠 組湯 加 減組0.0 0 01.2——80+.0 0 12 8 . 0 333 3318236 81071.....84846 26367±±±±±24333 93692.....36444 59267 ?## 111 18109 83681.....15225 53158±±±±±21222 86533.....52685 67532 ?## 31322 52597.....31744 45583±±±±±85876.....57182 12926 ?### 10 4877.....23981 68643±±±±±42323.....60711 24256 ?### 11111 60654 30068.....70941 55254±±±±±42333 14712.....60579 93614?##

3.2 對GAD、GS 蛋白表達的影響 圖1、表2 顯示，與空白組比較，模型組GAD 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），GS 蛋白表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，聯合組、艾司唑侖組、黃連阿膠湯加減組前者蛋白表達（除黃連阿膠湯加減組下丘腦外） 顯著升高（P＜0.05），后者蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。

3.3 對大鼠下丘腦中神經遞質的影響 表3 顯示，與空白組比較，模型組5-HT、5-HIAA 水平顯著降低（P＜0.05），NA、DA 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，聯合組、艾司唑侖組、黃連阿膠湯加減組前兩者水平顯著升高（P＜0.05），后兩者水平（除艾司唑侖組DA 外） 顯著降低（P＜0.05）。

3.4 對大鼠血漿中神經遞質的影響 表4 顯示，與空白組比較，模型組5-HT、5-HIAA 水平顯著降低（P ＜0.05），NA、DA 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，聯合組、艾司唑侖組、黃連阿膠湯加減組前兩者水平（除黃連阿膠湯加減組5-HT 水平、艾司唑侖組5-HIAA 水平外） 顯著升高（P＜0.05），后兩者水平（除艾司唑侖組DA 外）顯著降低（P＜0.05）。

圖1 各組GAD、GS 蛋白表達

表2 對GAD、GS 蛋白表達的影響

表2 對GAD、GS 蛋白表達的影響

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量／（g·kg-1）腦干GAD下丘腦 腦干GS下丘腦空模聯艾黃白型合司連組組組唑阿 侖膠 組湯 加 減組0.0 0 01.2——80+.0 0 12 8 . 0 00000.....64665 71605 25146 62322±±±±±00000.....00000 85467 62222 21769 ?### 00000.....75765 26077 33815 44462±±±±±00000.....00000 74367 23522 47186 ?## 00000.....56666 98123 52506 38224±±±±±00000.....01000 72687 58229 61868 ?### 00000.....46556 59672 99231 28699±±±±±00000.....00000 69667 25233 93914?###

表3 對大鼠下丘腦中神經遞質的影響

表3 對大鼠下丘腦中神經遞質的影響

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量／（g·kg-1） 5-HT／（μg·g-1） NA／（μg·g-1） 5-HIAA／（μg·g-1） DA／（μg·g-1）空模聯艾黃白型合司連組組組唑阿 侖膠 組湯 加 減組0.0 0 01.2——80+.0 0 12 8 . 0 10100.....15088 84221 59643 94418±±±±±00000.....00000 96886 52564 79129 ?### 01111.....95012 56751 32293 78626±±±±±00000.....01001 92991 55250 69439 ?### 00000.....42433 51178 07653 23317±±±±±00000.....00000 73675 26211 91766 ?### 12111.....50696 16214 94355 19234±±±±±00000.....11111 15245 43510 84476?##

表4 對血漿中神經遞質的影響

表4 對血漿中神經遞質的影響

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 劑量／（g·kg-1） 5-HT／（μg·L-1） NA／（μg·L-1） 5-HIAA／（μg·L-1） DA／（μg·L-1）空模聯艾黃白型合司連組組組唑阿 侖膠 組湯 加 減組0.0 0 01.2——80+.0 0 12 8 . 0 331 3185258.....42585 28223±±±±±76776.....22603 64169 ?## 1 30345 62733 24219.....98728 23192±±±±±24333 92147.....23262 67911 ?### 111 76574.....52217 39762±±±±±32332.....14109 63862 ?## 25343 34193.....51528 26257±±±±±79789.....16427 91242?##

4 討論

失眠屬中醫“不寐”“不瞑” “不得臥” 等范疇［11］，認為腦卒中后神經支配功能受損，脈絡痹阻，氣血運行不暢，日久化火傷陰，耗傷陰液，陽不交陰，氣機逆亂，上犯于腦，而腦為人體元神之府，元神驚擾時心神失養，導致失眠［12］。黃連阿膠湯源自《傷寒論》，由黃連、黃芩、白芍、雞子黃、阿膠組成，用于心腎不足、陰虛火旺較重的心煩失眠，方中黃連瀉心火除煩，配伍黃芩則清火力大；阿膠益腎水，佐芍藥則益水力強；去雞子黃加生地滋陰降火，養血生津，陰生火降而神有所藏，而加當歸補血活血，滋陰潤燥，血足血行而神有所屬；阿膠滋陰補血，滋腎陰以養氣血，為潤燥良品，加少許黃芪補氣升陽， “養靜”之陰藥中加入“走動” 之陽藥，行而不滯，陽中求陰，共奏滋陰養血、寧心安神之效。

5-HT 又稱血清素，是廣泛存在于哺乳動物組織細胞中的抑制性單胺類神經遞質，作為可產生愉悅情緒的信使，它幾乎影響到大腦皮層感受的每一向功能，從調節心情、判斷力、記憶力到塑造人生觀，主要分布于下丘腦與松果體，可參與痛感、睡眠等生理活動的調節［13］，中樞神經系統中其水平降低可導致偏頭痛、失眠、抑郁等多種疾病發生，在外源性刺激作用下5-HT 釋放、分布到血液中，主要被血小板攝取、儲存，儲存量占機體8%左右；5-HIAA 是5-HT 代謝最終產物，在中樞神經系統調節中具有重要作用［14］，精神病、腦功能障礙、睡眠障礙、苯酮尿癥患者其水平減少；NA 是一種維持生命活動的重要神經遞質，腦組織中它主要來自交感節后神經元與腦內腎上腺素能神經末梢，循環血液中的主要由其腎上腺髓質合成和分泌［15］，可收縮血管，導致血壓上升，增加冠狀動脈血流量，同時可增強心肌收縮力，導致血供減少，缺血加重，擴大梗死范圍；DA 是由腦組織分泌的一種神經傳導遞質，負責大腦皮層感覺、情緒信息傳遞，它作用于腦組織神經系統，可提高記憶力，在睡眠和覺醒中發揮重要作用［16］，其水平降低會導致控制肌肉能力下降，直接影響人們情緒。本實驗發現，艾司唑侖聯合黃連阿膠湯加減可有效改善腦卒中后失眠血虧陰證大鼠睡眠狀況，其作用機制可能為升高下丘腦和血漿中5-HT、5-HIAA 水平，降低NA、DA 水平，從而改善腦部組織微循環，修復受損神經功能，松弛肌肉，擴張血管，增加腦組織供血供氧量，調節心情。