丹參中有效成分聯合提取工藝的優化

林大專， 張義英， 王俊儒

（1.長春醫學高等專科學校，吉林 長春130031；2.西北農林科技大學理學院，陜西 楊凌712100）

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖，主要有效成分為水溶性的酚酸類和脂溶性的丹參酮類，藥理活性廣泛，在治療心血管疾病、肝硬化、潰瘍、腫廇、新生兒缺氧性腦病等具有顯著療效［1］。上述2種成分在同一工藝中不易兼得，但多種新技術聯合、多種成分標準控制的生產工藝是近幾年發展趨勢，后者一般采取傳統的回流提取，適合工業化生產［2］；也有用超聲提取的，提取率較高［3］，一般作為輔助技術；還有超臨界萃取法，但成本較高［4］，而前者常采用水煮醇沉法。目前，尚無對丹參中脂溶性、水溶性成分同時提取的報道，故建立聯合提取工藝很有必要，這樣既可降低成本，又能提高有效成分利用率，故本實驗采用正交試驗優化丹參中有效成分（酚酸類和丹參醌類） 聯合提取（回流提取為主，超聲提取為輔） 工藝，以期為這些成分開發利用提供參考。

1 材料

丹參購于安國市昌達中藥材飲片有限公司，經長春醫學高等專科學校生藥教研室王月珍老師鑒定為正品，符合2015 年版《中國藥典》 一部規定。丹參酮ⅡA對照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號Q0070291，50 mg，含有量≥99%）；丹酚酸B 對照品（北京百歐博偉生物技術有限公司，批號151219，20 mg／支，含有量≥98%）；

Agilent 1200 高效液相色譜儀，配置Agilent 1200 可變波長檢測器（VWD）、Agilent 1200 數據站、P／N-7725i 手動進樣器、G1354A 四元梯度泵、G1316A 柱溫箱 （美國Agilent 公司）；BS224S 電子天平［賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］；KQ-2200E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-2 恒溫水浴鍋（金壇市新航儀器廠）。

甲醇為色譜純（上海興科高淳溶劑有限公司，批號021260703）；乙腈為色譜純（美國Honeywell 公司，批號10071743）； 無 水 乙 醇 （批 號2015130）、 甲 酸 （批 號20040315） 為分析純（北京化工廠）。

2 方法

2.1 聯合提取 參考文獻［5］ 發現，70%乙醇提取效果最好，同時結合脂溶性或水溶性單一成分采用超聲提取。取丹參約2.0 g，先用6 倍量70%乙醇超聲提取2 次，每次30 min，溫度50 ℃，合并提取液，然后藥渣進行回流提取，最后將超聲、回流提取液合并，定容于100 mL 量瓶中。以乙醇體積分數（A）、料液比（B）、提取時間（C）為影響因素，正交試驗優化提取工藝，因素水平見表1，結果見圖1～2。

表1 因素水平

圖1 提取次數對丹參酮ⅡA 提取率的影響

2.2 丹參酮ⅡA含有量測定

圖2 提取次數對丹酚酸B 提取率的影響

2.2.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇-水（80 ∶20）；檢測波長270 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取丹參酮ⅡA對照品0.005 2 g，甲醇溶解定容至50 mL，即得（104 μg／mL）。

2.2.3 線性關系考察 精密吸取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，精密量取20 μL，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。以峰面積（Y） 對溶液質量濃度（X） 進行回歸，得方程為Y=164.4X+33.76（r=0.999 3），在5.2～31.2 μg／mL范圍內線性關系良好。

2.2.4 精密度試驗 精密量取對照品溶液1.5 mL 于10 mL量瓶中，甲醇定容至10 mL，平行6 份，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定， 測得丹參酮ⅡA峰面積RSD 為1.261%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 穩定性試驗 稱取丹參10 g 于250 mL 錐形瓶中，6倍量70%乙醇提取2 次，提取液濃縮至50 mL，精密量取15 mL 于25 mL 量瓶中，70%乙醇定容，搖勻，取6 份，每隔40 min 在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定至4 h，測得丹參酮ⅡA峰面積RSD 為0.858%，表明溶液在4 h 內穩定性良好。

2.2.6 重復性試驗 按“2.2.5” 項下方法制備提取液，平行6 次，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得丹參酮ⅡA含有量RSD 為1.694%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密量取提取液4.0 mL 于10 mL量瓶中，共9 份，加入丹參酮ⅡA對照品溶液0.5、1.0、1.5 mL，分別配制成高、中、低質量濃度，各3 份，70%乙醇定容，在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，丹參酮ⅡA平均加樣回收率為100.75%，RSD為1.07%。

2.3 丹酚酸B 含有量測定

2.3.1 色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇-乙腈-甲酸-水（25 ∶15 ∶1 ∶59）；檢測波長286 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫20 ℃；進樣量20 μL。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取丹酚酸B 對照品0.025 0 g，80%甲醇溶解，轉移至25 mL 量瓶中，即得（1 mg／mL）。

2.3.3 線性關系考察 精密量取對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 至5 mL 量瓶中，80%甲醇定容至5 mL，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定。以峰面積（Y） 對溶液質量濃度（X） 進行回歸，得方程為Y=16 780X-669.89（r=0.999 4），在0.1～0.7 mg／mL 范圍內線性關系良好。

2.3.4 精密度試驗 精密量取對照品溶液1.0 mL 至5 mL量瓶中，80%甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取6 份，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得丹酚酸B 峰面積RSD 為0.473%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩定性試驗 精密稱取藥材約2 g 于100 mL 具塞錐形瓶中，加入10 倍量50%乙醇，40 ℃下超聲提取3 次，每次30 min，提取液過濾合并，定容至100 mL 量瓶中，取6 份，每隔40 min 在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定至4 h，測得丹酚酸B 峰面積RSD 為0.617%，表明該方法穩定性良好。

2.3.6 重復性試驗 按“2.3.5” 項下方法制備提取液，平行6 次，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，測得丹酚酸B 含有量RSD 為0.844%，表明該方法重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密量取“2.3.5” 項下提取液5 mL 于50 mL 量瓶中，50%乙醇稀釋至刻度，精密量取2.0 mL 于5 mL 量瓶中，共9 份，加入對照品溶液0.5、0.7、0.9 mL，配制成高、中、低質量濃度各3 份，50%乙醇定容，在“2.3.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，丹酚酸B 平均加樣回收率為100.56%，RSD為1.66%。

3 結果

綜合評價［6-7］是運用數學方法（包括數理統計方法）對一個復雜系統的多個指標信息進行分析處理，以得到多個指標之間的優劣的評價方法。由于本實驗是通過聯合提取對丹參中酚酸類和丹參酮類同時進行提取，故丹酚酸B和丹參酮ⅡA都是重要的考察指標，兩者權重系數均為0.5，再進行加權求和，綜合評分=0.5×丹酚酸B 含有量／最大值+0.5×丹參酮ⅡA含有量／最大值。結果見表2，方差分析見表3。

表2 試驗設計及結果

由表2 可知，各因素影響程度依次為C（提取時間） ＞B（料液比） ＞A（乙醇體積分數）。其中因素A 為K2＜K3＜K1，因素B 為K1＜K2＜K3，因素C 為K1＜K2＜K3；由表3 可知，因素B、C 有顯著差異（P＜0.05），而因素A 無顯著差異（P＞0.05），最終確定最優工藝為A1B3C3，即先用6倍量70%乙醇超聲提取2 次，每次30 min，提取溫度50 ℃，再用30%乙醇回流提取3 次，每次90 min，料液比1 ∶10。根據上述優化工藝進行3 批驗證試驗，結果見表4，可知工藝穩定可行。

表3 方差分析

表4 驗證試驗結果（n=3）

然后，進行單一方法對照平行試驗，結果見表5，可知此時丹酚酸B、丹參酮ⅡA含有量明顯低于聯合提取時。

表5 單一方法對照平行試驗結果（n=3）

4 討論

本實驗選擇提取次數3 次，乙醇體積分數30%、50%、70%，這樣有利于丹參酮類、酚酸類成分同時提取。單用回流提取時，乙醇體積分數對丹參酮ⅡA、丹酚酸B 含有量有明顯影響；聯合提取時，該因素無明顯影響，其原因可能是70%乙醇超聲提取時已將兩者部分提取出，再用不同體積分數乙醇回流提取后即無明顯差異。

前期研究［8-14］大多僅以水溶性的酚酸類成分或脂溶性的丹參酮類成分為指標來優化丹參提取工藝，并均采用單一提取方法；本實驗同時考慮上述2 種成分，并采用聯合提取，發現該方法穩定可行，兩者含有量較高，而且有利于質量控制，提高藥材利用率，降低生產成本，為實際應用提供參考依據。另外，由于丹參有效成分的提取方法很多，而本實驗僅選擇超聲、回流聯合提取，故對其他提取方法的聯合效果尚有待于進一步研究。