木犀草素磷脂復合物的制備、表征及體內藥動學行為

李陽杰， 周 敬

（鄭州工業應用技術學院，藥學與化學工程學院，河南 鄭州451150）

木犀草素是黃酮類化合物，主要存在于白毛夏枯草、金銀花、野菊花等植物中，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保肝等多種藥理作用［1-2］，臨床適用于慢性支氣管炎、支氣管哮喘患者鎮咳、祛痰［3］，但其水溶性和脂溶性均較低［4］，導致藥物吸收存在較大問題［5］。磷脂復合物是中藥活性成分和磷脂通過氫鍵等分子間作用力結合形成的不同于原型藥物的一種復合物，可使中藥活性成分由結晶狀態轉變為無定型狀態，從而促進吸收，增加口服吸收生物利用度［6-13］，但其在水相中的穩定性存在一定問題，故選擇合適給藥形式對其生物利用度有重大影響［9-10］。孫宇薇等［4］對木犀草素磷脂復合物進行了初步研究，但復合率很低，僅約77%；本實驗重新對處方工藝進行研究，采用正交試驗優化木犀草素磷脂復合物制備工藝，并考察該制劑基本性質和體內藥動學行為，以期為其藥效學研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配置DAD 檢測器（美國Agilent 公司）；DF-101S 型磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；NAI-DCY-12Y 型圓形水浴氮吹儀（上海那艾精密儀器有限公司）；THZ-92A 型恒溫振蕩器（上海翠柳實驗儀器有限公司）；XW-80A 型漩渦混合器（上海醫科大學儀器廠）；D8 型X 射線粉末衍射儀（瑞士Bruker 公司）。

1.2 材料 木犀草素對照品（批號111520-201605，含有量99.6%，中國食品藥品檢定研究院）；香葉木素對照品（批號P0587，含有量99.4%，上海源葉生物科技有限公司）；卵磷脂（批號PC-98T，輔必成上海醫藥科技有限公司）。四氫呋喃為色譜純（德國Merck 公司）；司盤80（批號S-20161202，臨沂優尼特生物科技有限公司）；正辛醇、鹽酸、高氯酸等（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 動物 SD 大鼠，雌雄兼具，體質量（300±20） g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK（滬）2012-0002。

2 方法與結果

2.1 木犀草素含有量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.1%磷酸二氫鉀（7 ∶3）；檢測波長348 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

2.1.2 方法學考察 精密稱取木犀草素對照品25.0 mg，置于100.0 mL 量瓶中，加入約70 mL 乙腈超聲溶解，靜置至室溫后定容，即得250.0 μg／mL 貯備液，精密量取適量，進一步稀釋成5.0、10.0、25.0、50.0、125.0 μg／mL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以峰面積（Y） 對溶液質量濃度（X） 進行線性回歸，得方程為Y=0.030 6X-0.002 7（r=0.999 8），在5.0～125.0 μg／mL 范圍內呈良好的線性關系。

然后，分別取高（125.0 μg／mL）、中（50.0 μg／mL）、低（5.0 μg／mL） 質量濃度對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。結果，日內精密度RSD 為0.51%、0.32%、0.66%， 日間精密度RSD 為0.67%、 0.52%、0.93%，3 種質量濃度溶液的平均加樣回收率分別為100.22%、99.64%、99.40%，RSD 分別為0.71%、0.84%、1.42%，表明該方法穩定可靠。

2.2 復合率測定 稱取適量木犀草素與大豆卵磷脂在一定條件下進行反應，即得磷脂復合物，加入5 mL 二氯甲烷，振蕩溶解，0.22 μm 微孔濾膜過濾除去未參加復合的木犀草素，收集濾液，除去二氯甲烷，收集固體，并加入5 mL乙腈，稱定質量后繼續振蕩溶解，補加乙腈至振蕩前質量，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測定參加復合的木犀草素質量，計算復合率，公式為復合率=X1／X0×100%。其中，X1為磷脂復合物中木犀草素質量，X0是木犀草素總質量。

2.3 正交試驗 采用溶劑揮發法制備磷脂復合物。稱取適量木犀草素和大豆卵磷脂，加入四氫呋喃，在一定溫度條件下恒溫攪拌，減壓旋蒸，除去有機溶劑，40 ℃真空干燥箱中過夜干燥，即得，于干燥器中保存備用。

前期預實驗發現，磷脂復合物復合率主要受攪拌時間（A）、攪拌溫度（B）、木犀草素質量濃度（C）、木犀草素與大豆卵磷脂比例（D） 影響，故以四者為影響因素設計正交試驗，并以復合率為評價指標。因素水平見表1，結果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平

表2 試驗設計及結果

表3 方差分析

由表可知，因素B 對復合率有顯著影響（P＜0.05），而其他3 種因素無顯著影響 （P ＞0.05）；最優工藝為A3B3C2D2，即按1 ∶1.2 比例稱取木犀草素、大豆卵磷脂，加入適量四氫呋喃使前者質量濃度為15 mg／mL，在55 ℃下恒溫攪拌5 h，減壓旋蒸除去有機溶劑，40 ℃真空干燥箱中過夜干燥，復合率均接近100%。

2.4 X 射線衍射（XRD） 分析 檢測條件為Cu-Kα 靶，電流40 mA，掃描范圍3°～45°，掃描速度8°／min，結果見圖1。由圖可知，木犀草素XRD 圖譜有許多晶型峰，以結晶狀態存在，可能是因為木犀草素、大豆卵磷脂極性端發生了作用，導致磷脂復合物中兩者特征晶型峰均消失，最終呈現無定型狀態，也證明磷脂復合物制備成功。

圖1 樣品XRD 圖

2.5 溶解性測定 將過量木犀草素、物理混合物、磷脂復合物置于三角瓶中，加入蒸餾水（或正辛醇），室溫下磁力攪拌24 h，6 000 r／min 離心15 min，小心吸取上清液，過濾，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，計算表觀溶解度，結果見表4。由表可知，磷脂復合物在水中的表觀溶解度較木犀草素顯著提高（P＜0.01），同時在正辛醇中也顯著高于在水中（P＜0.01）。

表4 樣品表觀溶解度測定結果

表4 樣品表觀溶解度測定結果

注：與同一溶劑中木犀草素比較，??P＜0.01；與水中磷脂復合物比較，##P＜0.01

樣品 水／（μg·mL-1） 正辛醇／（μg·mL-1）木犀草素 53.83±0.42 511.51±3.14物磷理脂混復合合物物 1 71 03..19 74± ±01..52 57 ?? 4 56 97 01..85 85± ±61.8 4.3 46??##

2.6 體內藥動學行為

2.6.1 灌胃供試液制備 取木犀草素適量，置于含0.5%CMC-Na 的蒸餾水中，超聲分散，配制成15 mg／mL 混懸液，同法配制15 mg／mL（以木犀草素計） 磷脂復合物混懸液；取磷脂復合物適量，加入0.2 mL 司盤80，輕微研磨后置于中鏈甘油三酯中超聲溶解，配制成15 mg／mL（以木犀草素計） 澄清狀態的油制劑。

2.6.2 給藥及取血［11］18 只大鼠于實驗室環境中適應1 d，禁食不禁水，按30 mg／kg 劑量分別灌胃給予木犀草素混懸液、磷脂復合物混懸液、磷脂復合物油制劑，于0.15、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12 h 眼眶取血各約0.3 mL，置于肝素化離心管中，4 000 r／min 離心4 min，分取上層血漿，-20 ℃冰箱中冷凍保存。

2.6.3 樣品處理 精密吸取大鼠血漿樣品100 μL、內標溶液20 μL，置于離心管中，加入3 mol／L HCl 溶液100 μL，渦旋混勻后在75 ℃水浴中放置2.5 h，加入5%HClO4溶液150 μL，3.0 mL 乙酸乙酯提取，渦旋15 min，10 000 r／min離心12 min，轉移上層有機相于另一空白離心管中，再加入1.0 mL 乙酸乙酯同法提取，合并提取液，氮氣吹干，100 μL 流動相復溶。

2.6.4 內標溶液制備 精密稱取香葉木素對照品25.0 mg，置于100 mL 量瓶中， 加入乙腈超聲溶解定容， 得0.25 mg／mL貯備液，精密量取2.0 mL 于50 mL 量瓶中，混勻后定容，質量濃度為10 μg／mL，繼續精密量取1.0 mL于10 mL 量瓶中，混勻后定容，即得（1.0 μg／mL）。

2.6.5 方法學考察 取“2.1.2” 項下50.0 μg／mL 對照品溶液，逐步稀釋成25.0、12.5、5.0、1.25、0.25 μg／mL，各取20 μL，加入180 μL 大鼠空白血漿，按“2.6.3” 項下方法處理，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以木犀草素質量濃度為橫坐標（X），木犀草素、內標峰面積比例為縱坐標 （Y） 進行回歸， 得方程為Y=1.162 2X+11.652 0（r=0.991 3），在25.0～2 500 ng／mL 范圍間呈良好的線性關系。空白血漿、 對照品溶液、 供試品溶液HPLC 色譜圖見圖2，可知血漿內源性物質不干擾木犀草素和內標色譜峰，方法專屬性良好。

取含25、150、 2 500 ng／mL 木 犀 草 素 的 血 漿， 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。結果，3 種質量濃度日內精密度RSD（n=3） 分別為9.91%、5.32%、6.08%，日間精密度RSD（n=3） 分別為9.17%、8.69%、7.34%；將實際測定的質量濃度與配制的質量濃度比較，測得平均加樣回收率在88.16%～93.09%之間；以信噪比S／N≥10 為定量限，S／N≥3 為檢測限，測得兩者分別為2.5、1.25 ng／mL。

2.6.6 考察方法 繪制血藥濃度-時間曲線，計算主要藥動學參數，結果分別見圖3、表5。由此可知，磷脂復合物混懸液Cmax、AUC0～t、AUC0～∞與木犀草素混懸液比較均有所提高，但不明顯（P＞0.05）；磷脂復合物油制劑tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞與磷脂復合物、木犀草素混懸液比較均顯著升高 （P ＜0.05，P ＜0.01），生物利用度提高2.09 倍。

圖2 木犀草素HPLC 色譜圖

圖3 樣品血藥濃度-時間曲線

表5 樣品主要藥動學參數

表5 樣品主要藥動學參數

注：與木犀草素混懸液比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與磷脂復合物混懸液比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

參數 單位 木犀草素混懸液 磷脂復合物混懸液 磷脂復合物油制劑tCmmaxa x ng·m h L-1 61 03..87 07± ±05.5 1.53 4 84 08..85 42± ±02.1 16 7. 87 1 19 15..98 03± ±02.5 35 3.4#Δ 5##ΔΔ AUC0～t ng·mL-1·h 1 809.83±241.61 2 346.24±293.66 3 783.93±371.54##Δ AUC0～∞ ng·mL-1·h 1 970.14±289.04 2 486.62±312.40 3 905.46±411.43##Δ

3 討論

本實驗將制備溶劑四氫呋喃替換了無水乙醇，同時提高制備溫度，此時木犀草素磷脂復合物復合率接近100%，高于無水乙醇中，其原因可能是乙醇分子中有可作為氫鍵給體的-OH 鍵，在一定程度上干擾了藥物與磷脂形成復合物，導致復合率相對較低。木犀草素在血漿中容易與血清白蛋白形成一種結合物，為了準確測定血藥濃度，必須使該成分從結合態游離出來，故在進行血漿樣品處理時，依次采用鹽酸、高氯酸對蛋白進行水解沉淀，取得了良好的結果。

另外，木犀草素磷脂復合物混懸液Cmax、 AUC0～t、AUC0～∞與木犀草素混懸液比較無明顯差異，這可能是由于木犀草素與磷脂之間的作用力太弱，導致磷脂復合物以混懸液形式給藥時由于水相干擾，使藥物與磷脂發生了解離；以油制劑形式給藥時，可避免水相對其干擾，為順利透膜吸收奠定了基礎。