不同發育期忍冬花顏色與氣味變化

馬 云， 王堯堯， 管明瑞， 張 玉， 石曉晨， 席曉志， 張 芳， 李 佳， 張永清

（山東中醫藥大學，山東 濟南250355）

忍冬Lonicera japonica Thunb.為忍冬科多年生木質藤本植物，可藥用部位多，具有及其重要的藥用價值，其干燥花蕾或帶初開的花即是著名的常用中藥金銀花［1］。金銀花主要藥理作用包括抗菌、抗炎、抗病毒［2-4］等，臨床多用于呼吸道感染、口腔潰瘍、感冒發燒、高血脂等疾病［5］，年需求量在2 000 萬公斤以上，屬常用大宗中藥材。金銀花是藥食同源的藥材，在醫藥、食品、飲品、保健品、化妝品等多個領域被廣泛應用。忍冬花于每年3、4 月份開始孕育，5 份開始采收， 歷時接近60 d，整個花期分為花芽分化、花蕾發育、花朵開放及花朵凋落幾個階段。2015 年版《中國藥典》規定金銀花為忍冬科植物忍冬L．japonica 的干燥花蕾或帶初開的花［1］；但是實際生產過程中由于采收方法、開放花時間等因素的限制，市場上流通的金銀花藥材并不全為忍冬干燥花蕾或帶初開的花。自古以來，顏色、氣味是傳統中藥材質量評價的重要指標，一些現代研究［6-8］也表明，顏色、氣味與藥材活性成分含有量息息相關。因此，本項目考慮通過系統研究忍冬花發育期間顏色、氣味的動態變化，用于確定忍冬花蕾發育期（成熟度）、保證金銀花藥材質量，對促進金銀花藥材的合理開發利用，對推動中醫藥產業健康、快速、可持續地發展具有深遠意義。

1 材料

Mettler Toledo LE204E 型、01193-YP601 N 型電子分析天平（廣州市授科儀器科技有限公司）；GLF-04 型密封型手提式粉碎機（江陰市康和機械制造有限公司）；BAG-9246A 型電熱鼓風干燥箱（上海市齊欣科學儀器有限公司）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WF30 精密色差儀（深圳微福光電科技有限公司）；FlavourSpec?氣相離子遷移譜聯用儀（食品風味分析與質量控制系統， 濟南海能儀器股份有限公司）。

在山東天華制藥有限公司于山東省平邑縣鄭城鎮建立的金銀花規范化種植基地，選擇5 年生金銀花植株進行采樣。經山東中醫藥大學張永清教授鑒定，確認采樣植株為忍冬科多年生木質藤本植物忍冬Lonicera japonica Thunb.品種系大毛花。2017 年5 月上旬，在種植基地隨機選定100 個忍冬植株，根據發育程度將忍冬花的發育分為米蕾期、三青期、二白期、大白期、銀花期、金花期等6 個不同時期，見表1。每株分別采集各發育期花蕾或花100 個，然后將100 株上各時期花蕾或花分別置于板篩內曬干，置硅膠干燥器中備用。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 顏色測定 使用精密色差儀對金銀花顏色指標進行測量并記錄。測量條件為光源D65；標準觀察角 度 是10°； 照 明 口 徑Ф50 mm； 掃 描 速 度600 nm／min；波長掃描范圍780 ～380 nm。用色空間法表示數據［9］，L?值為明亮度，L?越大越亮，越小越暗；a?值為紅綠色度，a?值越大越偏紅，越小越偏綠；b?值為黃藍色度，b?值越大越偏藍，越小越偏黃色。見圖1，并通過計算得出褐變系數（BI）［10-11］。取不同生長發育期忍冬花樣品，粉碎，過40 目篩，取適量粉末放入色差儀粉末測試盒進行測量，每個樣品平行測定10 次。

2.2 氣味測定 精密稱取忍冬花樣品粉末0.5 g，置于20 mL 頂空進樣瓶中；45 ℃、500 r／min 下孵化10 min，頂空進樣；進樣針溫度85 ℃；進樣體積500 μL。 5%苯基-甲基聚硅氧烷柱（15 m×0.53 mm，0.5 μm）； 柱 溫 40 ℃； 分 析 時 間30 min；載氣，高純N2；體積流量初始5 mL／min，保持2 min 后，18 min 內升至150 mL／min，保持10 min。IMS 溫度45 ℃。所得樣品的氣相離子遷移譜圖見圖2。

圖1 色空間法示意圖Fig.1 Schematic diagram of color space method

圖2 樣品氣相離子遷移譜圖Fig.2 GC-IMS chromatograms of sample

2.3 數據處理 采用Excel、Origin 9.0 對實驗數據進行分析。使用氣相離子遷移譜聯用儀控制系統進行忍冬花各發育期圖譜的統計學分析，包括相似度檢驗、樣品差異分析、動態主成分分析、揮發性有機物定性分析等。主成分分析［12］是1 種統計技術，用于通過將多個變量轉化為少量綜合變量來簡化1 個復雜問題，同時損失很少的信息。

3 結果與分析

3.1 顏色指標變化 圖3 表明，不同發育期的忍冬花蕾或花的L?值呈現先升高后降低的趨勢，大白期最高，為72.86；a?值隨忍冬花蕾的生長發育，其整體趨勢是逐步升高，但二白期和金花期均有稍下降趨勢，表明這2 個時期，花蕾往綠度值方向變化了微量；b?值除金花期稍有下降外，整個生長發育期均穩步增大；BI 值隨忍冬花蕾或花的生長發育逐漸升高，金花期稍有下降。

3.2 氣味指標變化

圖3 各發育時期花顏色指標Fig.3 Color indicator of flower samples at various development

3.2.1 相似度分析 對各發育時期忍冬花蕾或花樣品氣相離子遷移譜圖進行相似度檢驗得出，同一樣品相似度達95%，見圖4A，不同樣品間相似度僅56%，見圖4B，表明氣相離子遷移譜氣味測定試驗的可信度及重復率極高。

3.2.2 樣本間差異分析 不同發育期的忍冬花蕾或花的揮發性物質之間存在種類和濃度上的差異，而3 個相同發育期的忍冬花蕾或花平行樣之間相似度良好，見圖5A。為了進一步觀察，可選取一張譜圖作為參比，所有譜圖扣減這張譜圖，扣減后的譜圖中，背景越干凈，表示和參比的相似度越好。圖5B 中以17051906-2（金花期） 作為參比，同樣可以看出不同發育期的忍冬花蕾或花之間差異很大，而相同發育期樣品的3 個平行圖譜之間相似度很高。

圖4 各樣品相似度Fig.4 Similarities of various samples

圖5 不同發育期忍冬花蕾或花氣相離子遷移譜圖差異分析Fig.5 Difference analysis of GC-IMS of flower samples at various developments

3.2.3 樣本總體差異分析 首先在譜圖上選取信號峰，見圖6，將關注的峰標記起來（下圖僅為示例，選取的峰越多，越能真實反映樣品信息）；其次，選擇需要對比的6 個發育期樣品圖譜，系統將自動生成指紋圖譜，見圖7。表明每種樣品的完整揮發物信息以及樣品之間揮發性有機物的差異及變化；一些酯類成分 （2-甲基丁酸丁酯、異戊酸、異戊醛） 隨忍冬花成熟度的增加，逐漸增多，部分成分從無到有；異丁醇、乙酸丁酯等物質隨忍冬花成熟度增加而逐漸降低；另有2-己烯-1-醇和葉醇等物質隨著成熟度的增加，濃度逐漸升高又降低。

圖6 氣相離子遷移譜圖譜標記示例Fig.6 GC-IMS labeling example

3.2.4 動態主成分分析 不同發育期忍冬花氣味數據經動態主成分分析，見圖8，表明米蕾期和三青期（1～2 號） 比較接近，可聚為一類，三青期、二白期、大白期、銀花期、金花期（3 ～6 號） 可以很好的分開。

3.2.5 揮發性有機物定性 將通過氣相離子遷移譜測得的氣味數據與系統數據庫比對，得到確定的21 種成分，結果見圖9、表2。

4 討論與小結

由“辨狀論質”［13］理論可得，顏色是判斷忍冬花藥材等級的重要依據［14-15］，表明藥材顏色與其活性成分含有量是存在密切關系的。不同發育期忍冬花蕾或花的顏色指標中，a?值與多種活性成分呈顯著相關，表明花蕾顏色越綠，活性成分含有量越高，根據藥材顏色判斷活性成分含有量是有據可依的。

圖7 各發育期樣品總體氣相離子遷移譜指紋圖譜Fig.7 GC-IMS fingerprints of samples at various developments

圖8 各發育期樣品總體氣相離子遷移譜主成分分析Fig.8 PCA analysis of total GC-IMS of samples at various developments

圖9 樣品氣相離子遷移譜圖成分定位、編號Fig.9 GC-IMS component localization，numbering

現階段， 氣相離子遷移譜多應用于食品方面［16］，如豬肉、羊肉、香煙、水果、葡萄酒等食品的風味鑒別；本研究將其用于測定不同發育期忍冬花蕾或花的氣味，發現相同發育期樣品的氣味相似度極高，不同發育期樣品的氣味數據存在可分辨差異，相似度、差異檢驗等分析均證明此方法可對忍冬花藥材氣味進行分析量化；此外，不同發育期的忍冬花蕾或花揮發性物質存在很大差異，部分成分從有到無，部分成分從無到有，部分成分先增加后降低。但是由于此技術在中藥材方面應用較少，系統數據庫有待進一步補充，不能對所有可測得的成分進行定性定量分析。

本研究對不同發育期忍冬花蕾或花的顏色、氣味進行研究，拓展了GC-IMS 的應用領域。建立不同發育期忍冬花蕾或花的顏色、氣味的指紋信息模型庫，為忍冬花及其他中藥原料的品種鑒別提供依據。

表2 氣相離子遷移譜測得揮發性有機物Tab.2 Determination of volatile organic compounds by GC-IMS