UPLC 法測定不同海拔及不同采收期烏梅中枸櫞酸和蘋果酸

群 培， 翟 雪，2， 金 乾， 楊正明，3?， 劉 圓

（1.西南民族大學藥學院，四川 成都610041；2. 四川省廣安市岳池縣農業局，四川 廣安638300；3.四川農業大學農學院，四川 成都611130；4.西南民族大學民族醫藥研究院，四川 成都610041）

烏梅為薔薇科植物梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.et Zucc. 的干燥近成熟果實。始記載于《神農本草經》［1-2］，其味酸， 性平無毒， 歸肝、 脾、肺、大腸經［3-4］，有斂肺、澀腸、生津、安蛔、增強機體的免疫功效。用于治療肺虛久咳、久瀉久痢、虛熱煩渴、便血尿血等癥［4-7］，在我國中藥及民族藥中已廣泛使用。關于烏梅的入藥形式，歷代本草及相關標準記載中均有去核和連核使用2 種，現代相關研究證明烏梅中的有效成分有機酸及水浸出物大多集中在果肉中，核中含有量甚少［8］。烏梅除作藥物使用外，還可制作果脯、飲料等，是國家公布的1 種重要的藥食兩用傳統藥材，也被廣泛應用于清咽類保健食品中［9-11］。

烏梅除含有氨基酸、黃酮、揮發油、生物堿、甾醇類外，還含有豐富的有機酸［12-13］，如枸櫞酸、蘋果酸、延胡索酸、琥珀酸、乳酸、草酸等，具有軟化血管、 防老抗衰、 抗菌、 抗變態反等作用［14-15］。臨床用于肺虛久咳、久痢滑腸、虛熱消渴、蛔厥腹痛等癥［16］。多年以來，歷版《中國藥典》 對烏梅藥材的優劣鑒別多以有機酸（以枸櫞酸計） 含有量為質量控制指標，并且課題組前期研究發現，烏梅中有機酸含有量最多為枸櫞酸和蘋果酸，為其主要成分，具有抑菌、抗驚厥、抗病毒、抗腫瘤和抗氧化、止血、降低血脂和降血糖等多種藥理作用［17-19］。 王璐等［16，20］研究表明降血糖作用與烏梅中的蘋果酸和枸櫞酸有關。枸櫞酸廣泛應用于食品飲料、醫藥化工、清洗與化妝品、有機材料等領域，是目前世界上需求最大的有機酸；蘋果酸廣泛分布于動物、植物及微生物細胞中，具有抗疲勞、改善記憶力、保護心臟等作用，同時在食品領域也發揮著巨大作用。本研究建立UPLC 法測定不同海拔、不同采收期烏梅果實（去核） 中蘋果酸和枸櫞酸的含有量，以期為其臨床應用和新藥開發以及食用方面提供參考。

1 材料

1.1 儀器與試劑 Waters Acquity UPLC?H-Class

超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Milli-Q 超純水機（美國Millipore 公司）；DHG-9246A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏試驗設備有限公司）；JY-02 多功能粉碎機（永康浩瀚工貿有限公司）；METTLER TOLEDO TYPE AE240S 電子分析天平［瑞士梅特勒-托利多儀器 （上海） 有限公司］；KQ-5200E 型超聲波清洗器（40 kHz、250 W，昆山超聲儀器有限公司）。

枸櫞酸對照品（批號MUST-14091701）、蘋果酸對照品（批號MUST-14100803） 均購于成都曼思特生物科技有限公司；乙腈為色譜純（美國迪馬公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.2 藥材 梅果實樣品采集于四川省阿壩藏族羌族自治州金川縣，經西南民族大學劉圓教授鑒定為薔薇科植物梅Prunus mume（Sieb.） Sieb. et Zucc.的果實，見表1。樣品經去核、烘干粉碎后，過2號篩，備用。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件 ACQUITY HSS C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脫，洗脫程序見表2；體積流量0.2 mL／min；檢測波長210 nm；進樣量1 μL；柱溫35 ℃。分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液進樣，色譜圖見圖1。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2 溶液制備與標準曲線繪制

2.2.1 對照品溶液制備 分別稱取枸櫞酸、蘋果酸對照品適量，精密稱定，甲醇溶解定容至10 mL量瓶 中， 即 得2.056、 2.020 mg／mL 的 對 照 品母液。

2.2.2 供試品溶液制備 取0.5 g 干燥至恒定質量的梅果實（去核） 粉末，精密稱定，加入20 mL 80%甲醇溶液，超聲提取100 min，搖勻，過濾，取續濾液5 mL，減壓回收溶劑至干，殘渣用少量甲醇溶解并定容于10 mL 量瓶，經0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 標準曲線繪制 分別精密吸取枸櫞酸和蘋果酸對照品母液，用甲醇稀釋，并定容至2 mL，得系列質量濃度的對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下，以進樣量為橫坐標（X）、記錄色譜峰峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，以信噪比S／N=3作 為 檢 出 限 （LOD）， S／N=10 作 為 定 量 限（LOQ），結果見表3。

圖1 各成分UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of various constituents

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一蘋果酸和枸櫞酸混合對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下連續進樣6次，測得峰面積RSD 分別為0.82%、0.90%，表明該儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 稱取同一烏梅果實（去核）粉末（S1）6 份，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣，記錄峰面積，得枸櫞酸、蘋果酸含有量RSD 分別為0.88%、0.78%，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 稱取烏梅果實（去核） 粉末（S1），按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下，分別于1、3、5、7、12、24 h進樣，得枸櫞酸、蘋果酸含有量RSD 分別為1.44%、1.35%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗 取已知含有量的梅果實（去核） 粉末 （S1） 0.01 g，精密稱定6 份，加入適量枸櫞酸和蘋果酸對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下測定，計算回收率，結果見表4。

表4 各成分加樣回收率試驗結果（n=6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.4 樣品含有量測定 精密稱取梅果實（去核）不同海拔、不同采收期樣品粉末（過4 號篩） 各0.5 g，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進行測定，計算枸櫞酸和蘋果酸的含有量，結果見表5，不同海拔、不同采收期的烏梅果實中枸櫞酸和蘋果酸含有量變化趨勢見圖2～3。

表5 樣品中枸櫞酸和蘋果酸含有量測定n=3）Tab.5 Determination of citric acid and malic acid content in the fruits of samples

表5 樣品中枸櫞酸和蘋果酸含有量測定n=3）Tab.5 Determination of citric acid and malic acid content in the fruits of samples

編號 枸櫞酸 蘋果酸 總和S1 103.68±0.02 114.68±0.17 218.36±0.19 S2 108.96±0.05 121.96±0.09 230.92±0.14 S3 114.79±0.12 116.79±0.02 231.58±0.14 S4 116.35±0.07 113.35±0.09 229.70±0.16 S5 143.31±0.04 154.68±0.11 297.99±0.15 S6 159.96±0.06 148.96±0.12 308.92±0.18 S7 167.79±0.18 138.79±0.04 306.58±0.22 S8 168.35±0.06 131.35±0.05 299.70±0.11 S9 144.21±0.05 156.12±0.13 300.33±0.18 S10 153.28±0.02 150.31±0.07 303.59±0.09 S11 164.55±0.14 140.29±0.05 304.84±0.19 S12 162.22±0.05 132.45±0.11 294.67±0.16 S13 146.73±0.02 155.72±0.23 302.45±0.25 S14 155.46±0.04 149.24±0.08 304.7±0.12 S15 167.35±0.13 140.05±0.02 307.4±0.15 S16 165.03±0.06 134.93±0.09 299.96±0.15 S17 149.18±0.01 154.83±0.15 304.01±0.16 S18 158.37±0.09 148.54±0.13 306.91±0.22 S19 168.95±0.17 141.17±0.04 310.12±0.21 S20 166.44±0.08 136.43±0.10 302.87±0.18 S21 147.99±0.02 152.56±0.14 300.55±0.16 S22 156.87±0.09 146.22±0.05 303.09±0.14 S23 167.71±0.15 140.33±0.08 308.04±0.23 S24 164.40±0.05 137.14±0.03 301.54±0.08 S25 148.11±0.03 151.96±0.19 300.07±0.22 S26 157.08±0.05 144.27±0.05 301.35±0.1 S27 167.54±0.12 139.83±0.06 307.37±0.18 S28 164.32±0.03 136.74±0.05 301.06±0.08

圖2 不同采收期樣品中枸櫞酸和蘋果酸含有量變化趨勢Fig.2 Variation tendency of citric acid and malic acid in samples from different gathering periods

3 討論與結論

圖3 不同海拔和不同采收期樣品中枸櫞酸和蘋果酸含有量變化趨勢Fig.3 Variation tendency of citric acid and malic acid in samples from different altitudes and different gathering periods

本實驗采用UPLC 法對不同海拔、不同采收期的烏梅中枸櫞酸和蘋果酸進行含有量測定，結果表明海拔2 920 m 的樣品中兩者含有量明顯低于海拔小于2 400 m 的樣品；海拔2 920 m 的樣品中枸櫞酸含有量為103.68 ～116.35 mg／g，低于藥典規定的“不得小于12.0%”，而海拔低于2 400 m 的樣品中枸櫞酸含有量遠高于藥典要求；從5 月至8月，樣品中枸櫞酸含有量隨著月份的增加呈上升趨勢并趨于平衡，而蘋果酸的含有量隨著月份的增加呈下降趨勢。課題組前期查閱相關文獻得，這2 種有機酸與烏梅藥理作用關系密切，可將其列入烏梅及其制劑質量標準控制的項目。藥理作用極其廣泛，化學成分也十分復雜，早期果實（去核） 中枸櫞酸含有量低于蘋果酸，隨著果實成熟，枸櫞酸的含有量呈逐漸增加趨勢，至后期枸櫞酸含有量略高于蘋果酸［18-20］。對枸櫞酸和蘋果酸含有量而言，烏梅栽種在海拔2 400 m 以下的地區為宜，且以7至8 月采收期為最佳。

課題組分別考察了加熱回流和超聲提取，結果表明超聲提取效果優于加熱回流提取，故采用超聲提取；分別考察了甲醇、水、乙醇3 種不同溶劑的提取效果，結果表明以甲醇作為提取溶劑，枸櫞酸和蘋果酸含有量總和最高，故選擇甲醇作為提取溶劑；分別考察不同體積分數（50%～100%） 甲醇的提取效果，結果表明甲醇體積分數為80%時，枸櫞酸和蘋果酸含有量總和最高，故選擇80%甲醇；分別考察了不同料液比（1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50） 的提取效果，結果表明料液比為1 ∶40 時，枸櫞酸和蘋果酸含有量總和最高，故選擇料液比為1 ∶40；分別考察了超聲30、60、80、100、120 min 的提取效果，結果表明當超聲時間100 min 時，枸櫞酸和蘋果酸含有量總和最高，故選擇超聲時間100 min。結合多方法學考察，表明該方法準確穩定，重復性好，可用于烏梅的質量控制。