泥附子商品等級劃分合理性分析

李 潘， 賀亞男， 羅 杰， 裴 瑾，2， 林俊芝， 楊 明， 張定堃，2?

（1.成都中醫藥大學藥學院，中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137；2.四川好醫生攀西藥業有限責任公司，四川 西昌615000；3.成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都610072；4.江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌330004）

商品規格等級是中藥品質的重要外觀標志，也是中藥材“辨狀論質” “看貨評級，分檔議價” 的重要指標，在中藥材市場流通領域具有不可替代的作用 ［1-3］。為此，1984 年頒布了《七十六種藥材商品規格》，為中藥質量評價與市場流通起到重要作用。然而，中藥材生產方式發生了重大變化，栽培品大量取代野生品成為市場供應主流來源。同時，現代理化分析技術不斷發展與普及應用，傳統中藥材商品規格的科學性也備受質疑［4-7］。因此，有必要對中藥材商品規格等級劃分的合理性進行再認識與再評價。

附子是毛茛科烏頭屬植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根，是確有療效的有毒中藥。其毒烈，不少醫家避之如蛇蝎，終生不敢使用；其效彰，被譽為“回陽救逆第一品”，治病保命“藥中四維”［8-9］。因此，研究影響附子毒效的因素是藥材品質優良，用藥安全的重要保障。

關于附子的品質，從宋代起就有評價方法的論述。 《彰明附子記》 中記載，泥附子一般以“底平”“體圓” “皮黑” “肉花白” “八角” 或“九角” 者為佳；在質量上， “一個重一兩，即是氣全，堪用”。近幾十年來，關于泥附子感官評價的指標趨于簡化，如《七十六種藥材商品規格》主要以質量為評價［10-12］。在產地，附子收獲后也按照個頭大小分檔銷售、加工炮制。大附子用于加工炮天雄，作為溫腎助陽之佳品；中等個頭附子用于加工白附片、黑順片等，作為附子的主流飲片規格；小個頭附子直接干燥后充當川烏，作為祛風濕止痛藥。因此，深入探討個頭大小對附子毒效的影響規律，對于研究商品規格等級的合理性與科學性，指導附子種植、采收、良種選育、市場流通與臨床應用均具有重要意義。

1 材料

1.1 藥材 泥附子于2017 年6 月27 日采集于四川省江油市橋樓村GAP 種植基地的同一地塊，根據個頭大小，將附子分為5 個等級，分別為Ⅰ等0 g＜質量＜20 g、Ⅱ等20 g＜質量＜40 g、Ⅲ等40 g＜質量＜60 g、Ⅳ等60 g ＜質量＜80 g、Ⅴ等質量＞80 g。樣品經成都中醫藥大學藥學院裴瑾教授鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根，外觀性狀見圖1。樣品洗凈、切片、冷凍干燥，粉碎過2 號篩，備用。阿司匹林腸溶片，由拜耳醫藥保健有限公司生產，批號J20171021，使用前用0.5%CMC-Na 溶液配成阿司匹林混懸液。

圖1 不同等級樣品外觀性狀Fig.1 Appearances of different grades of samples

1.2 試劑 烏頭堿、新烏頭堿、印烏頭堿、次烏頭堿、烏頭原堿、尼奧林、松果林、塔拉烏頭胺對照品均購于成都曼斯特生物有限公司，批號分別為MUST-16062206、 MUST-16032504、 MUST-16101810、MUST-16032106、 MUST-16060306、 MUST-16052503、MUST-17022505、MUST-16031801； 苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、附子寧、去甲烏藥堿、去甲豬毛菜堿對照品購于成都克洛瑪生物科技有限公司，批號分別為CHB160912、CHB151203、 CHB160326、 CHB160812、 CHB151111、CHB160922，所有對照品含有量均＞98%。色譜級二甲亞砜和甲酸購于成都市科龍化工試劑廠；超純水（自制）； 甲醇、 乙腈 （色譜純， 美國Fisher 公司）；屈臣氏蒸餾水購于廣州屈臣氏食品飲料有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3 動物 KM 小鼠，SPF 級，體質量18 ～22 g，雌雄各半；SD 大鼠，雄性，體質量180 ～200 g，均由成都達碩實驗動物有限公司提供，動物質量合格證號SCXK（川）2015-030，檢疫后備用。將動物保持在溫度（20±0.5）℃，濕度（55±5）%和12 h光照和12 h 黑暗循環的受控條件下，在實驗之前，動物禁食24 h，可自由飲水。

1.4 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀、Agilent 6460C 三重四極桿串聯質譜儀 （美國Agilent 公司）；BP211 DAG 電子分析天平（德國Satorius 公司）；CHRIST ALPHAI-4 LSC 冷凍干燥器（上海斯高勒生物科技有限公司）；KQ-500DB型數控超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；SZ-93 A 自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 含有量測定

2.1.1 供試品溶液制備 取樣品粉末各0.1 g，精密稱定，置10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，稱定質量，超聲提取30 min，取出，放冷，精密稱定，補足減失質量，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 分別取各對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成含14 種生物堿的混合對照品于棕色量瓶中， 質量濃度分別為烏頭堿1.905 μg／mL、新烏頭堿10.2 μg／mL、次烏頭堿2.032 μg／mL、印烏頭堿0.464 μg／mL、苯甲酰烏頭 原 堿 0.672 μg／mL、 苯 甲 酰 新 烏 頭 原 堿1.932 μg／mL、苯甲酰次烏頭原堿0.18 μg／mL、烏頭原堿0.104 μg／ mL、附子寧4.32 μg／mL、尼奧林2.032 μg／mL、塔拉烏頭胺0.33 μg／mL、松果林2.904 μg／mL、去甲烏藥堿0.134 μg／mL、去甲豬毛菜堿0.416 μg／mL。儲存于4 ℃的冰箱中，備用。

2.1.3 分析條件

2.1.3.1 色譜條件 Phenomenex C18色譜（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 ～1 min，2%～20%B；1 ～5 min，20%～50%B；5 ～10 min，50%～75%B；10～15 min，75%～100%B）；體積流量0.45 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

2.1.3.2 質譜條件 采用ESI 源，正離子模式檢測；脫溶劑溫度300 ℃；脫溶劑氣流N211 L／min；霧化器壓力103.425 kPa；毛細管電壓4 000 V；掃描方式為MRM 檢測，14 種生物堿成分的多反應監測模式信息見表1，MRM 色譜圖見圖2。

表1 各成分多反應監測模式信息Tab.1 MRM information of various constituents

2.1.4 方法學考察 參照ICH Q2B 技術指導原則進行。取對照品溶液適量，用甲醇稀釋為不同質量濃度梯度的對照品溶液，在擬定的HPLC-MS／MS條件下測定。以待測物質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸。同時測定各待測物的定量限（S／N=10） 和檢測限（S／N=3），各成分線性關系、LOD 和LOQ 的結果見表2。精密度、穩定性、重復性與加樣回收率前期已研究［13］，表明該方法能滿足含有量測定的要求。

表2 各成分線性關系、LOD 和LOQTab.2 Linear relationships，LOD and LOQ of various constituents

圖2 各成分MRM 色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of various constituents

圖3 不同等級附子的含有量測定結果Fig.3 Results of content determination of Aconite with different grades

表3 各成分含有量測定結果（μg／g，n=6）Tab.3 Results of content determination of various constituents（μg／g，n=6）

2.1.5 樣品含有量測定 取5 個不同等級的附子粉末，按“2.1.1” 項下方法制備樣品溶液，每個樣品平行制備6 份。在“2.1.3” 項條件下進樣，計算各供試品溶液中14 種生物堿的含有量，結果見表3。可知，不同等級附子中成分含有量具有顯著差別。隨著附子質量的增大， 雙酯型生物堿（烏頭堿、新烏頭堿、印烏頭堿） 與強心成分（去甲烏藥堿、去甲豬毛菜堿） 的含有量分別呈現降低、升高趨勢，單酯型生物堿（苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿） 含有量較低，無法比較組間差異， 其余5 種藥效成分（尼奧林、塔拉烏頭胺、松果林、附子寧、烏頭原堿） 具有升高趨勢，但組間差異并不明顯，見圖3。由此推測大個頭附子可能具有高效低毒的性能，而小個頭附子可能不僅低效，還具有大毒的藥性。因此，初步判定附子質量分級具有一定的合理性。2.1.6 聚類分析 采用HemI 分析軟件對5 種等級附子的含有量測定結果進行系統聚類分析，結果見圖4。根據14 種生物堿含有量的差異，5 種等級的附子可被分為0 ～60 g 和60 ～100 g 兩類，其中0～60 g 又被分為0 ～40 g 和40 ～60 g 兩類。因此“小個頭” 附子與“大個頭” 附子中生物堿含有量是有明顯差異的，并且同一等級附子組內差異小，證明了分級的科學性。另外，由熱圖顏色差異可知，新烏頭堿、次烏頭堿、附子寧、尼奧林、松果林的含有量高于其他生物堿，并且隨著附子等級的升高，大毒成分新烏頭堿和印烏頭堿的含有量顯著降低，鎮痛成分尼奧林和松果林的含有量明顯升高，進一步認為“小個頭” 附子具有毒性強、鎮痛功效弱的性能。

2.2 不同等級附子鎮痛實驗［14-15］

2.2.1 樣品制備 取5 個不同等級的附子各10 g，提取2 次，第1 次加10 倍量水，浸泡30 min 后，煎煮3 h；第2 次加8 倍量水，煎煮3 h，合并提取液，濃縮至質量濃度0.5 g 生藥／mL。取阿司匹林腸溶片適量， 研細， 用0.5% CMC-Na 配制成200 mg／kg 阿司匹林混懸液，作為鎮痛陽性藥。

圖4 各成分在不同等級附子中的平均豐度熱圖Fig.4 Thermograph of average abundance for various constituents in different grades of Aconite

2.2.2 對小鼠醋酸所致扭體反應的影響 取小鼠56 只，雌雄各半，隨機分為7 組，每組8 只。陽性對照組給予200 mg／kg 阿司匹林混懸液，空白組給予蒸餾水10 mL／kg，附子不同等級組均按5 g 生藥／kg 灌胃給藥，1 次／d，連續3 d。于末次給藥后1 h， 給予各組小鼠腹腔注射0.6% 冰醋酸10 mL／kg，立即計時，記錄小鼠首次出現扭體反應的時間作為潛伏期，同時記錄每只小鼠造模后15 min 內出現的扭體次數，結果見表4?？芍?，與空白組相比，陽性組與附子組對小鼠醋酸所致扭體反應的影響存在顯著差異，并且陽性組療效優于附子各組。但是，附子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組扭體次數無組間差異，其療效無顯著差別。另外，陽性組相比于空白組顯著增大了小鼠扭體潛伏期，附子組無顯著性影響，而隨著附子等級的升高，存在降低趨勢，表明“小個頭” 附子可能具有延長小鼠扭體潛伏期的效果。

2.3 不同等級附子最小致死量的測定［16-17］

2.3.1 樣品制備 取不同等級附子粉末2 g，精密稱定， 用20 mL 70%乙醇超聲提取30 min。在5 000 r／min的條件下離心10 min，分離上清液。取1 mL 上清液， 加入19 mL 生理鹽水稀釋， 經0.22 μm微孔膜過濾，得測試溶液。精密稱定烏頭堿對照品適量， 溶解在無水乙醇中， 配成200 μg／mL溶液，在測定當天用生理鹽水稀釋配成10 μg／mL 標準溶液。

表4 不同等級附子對小鼠醋酸所致扭體反應的影響n=8）Tab.4 Effects of Aconite with different grades on writhingresponse caused by acetic acid in mice

表4 不同等級附子對小鼠醋酸所致扭體反應的影響n=8）Tab.4 Effects of Aconite with different grades on writhingresponse caused by acetic acid in mice

注：與空白組比較，?P＜0.01

陽性組組別 7潛.7伏2±期3.／7m2i?n扭3.體50次±2數.5／6次?附子Ⅰ組 5.24±0.98 15.00±3.89?附子Ⅱ組 4.96±1.02 13.38±3.93?附子Ⅲ組 4.58±1.00 12.62±6.21?附子Ⅳ組 4.46±1.27 14.38±5.01?附子Ⅴ組 4.27±0.73 12.00±4.50?空白組 3.89±0.60 26.12±3.94

2.3.2 對大鼠最小致死量測定 取大鼠36 只，隨機分為6 組，每組6 只。實驗時，將每只動物固定，并將標準溶液或測試溶液通過緩慢推注入大鼠尾靜脈中，確保藥物作用迅速，直到動物死亡。以瞳孔擴張和呼吸停止視為死亡的臨界點，記錄推注量（V） 和體質量（m），并根據藥物濃度（c），由公式1 計算最小致死劑量（MLD），結果見表4。

此實驗以MLD 越小，代表毒性越大。見圖5，與烏頭堿組相比，附子組MLD 顯著升高，毒性降低。附子Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組MLD 高于附子Ⅰ、Ⅱ組，即毒性小于Ⅰ、Ⅱ組。另外，附子Ⅲ和Ⅴ組與其他3 組比較具有顯著性差異，其MLD 升高，表現出低毒，而附子Ⅲ組MLD 最高，可能與其毒性成分含有量低有關。并且發現隨著附子等級的升高，MLD 具有升高趨勢，毒性存在降低趨勢，但組間差異并不明顯。因此，附子等級的差異與毒性在一定程度上具有相關性，進一步證明了分級的合理性。

3 討論

圖5 不同等級附子對大鼠最小致死量的測定結果（n=6）Fig.5 Results of determination of the MLD in rats with different grades of Aconite（n=6）

本研究以化學分析為基礎，探討不同等級附子間的毒效關系，并以藥效與毒性實驗驗證附子分級的合理性。通過化學分析，14 種生物堿在不同等級附子中含有量存在顯著差異，而這種差異主要與生物堿在皮部、髓部的分布差異和累積規律有關［10］。附子的長大增重主要是形成層內的髓部比例增大，而形成層外的皮部與韌皮部比例相對降低。再結合新烏頭堿、次烏頭堿在皮部、髓部的含有量可知，雙酯型生物堿主要分布在形成層外的皮部與韌皮部，其含有量約為髓部的2 倍［2］。由此可知，大個頭附子中雙酯型生物堿含有量較低，主要是由髓部比例高，毒性成分含有量低決定的。并且隨著附子等級的升高，呈現出雙酯型生物堿降低的趨勢。而在測定最小致死量的實驗中， “大個頭”附子具有較高MLD，呈現出低毒藥性，兩組實驗結果相互驗證， 表明 “小個頭” 附子毒性強于“大個頭” 附子。

附子的鎮痛療效顯著，以鎮痛效果驗證附子分級的藥效研究具有代表性［18-20］。在對小鼠醋酸所致的扭體次數的影響研究中，附子水煎液與阿司匹林均具有顯著療效。然而，5 個等級附子的鎮痛效果在醋酸扭體實驗中并未呈現出顯著差異，可能是其生物堿含有量較高，均大于附子鎮痛活性的最高有效劑量，因此，不同等級附子間生物堿存在的差異難以通過鎮痛活性反映出來。根據化學分析結果，雙酯型生物堿在小個頭附子中含有量最高，又是鎮痛作用的主要成分，因此，隨著附子等級的升高，小鼠扭體潛伏期存在縮短的趨勢。

綜上，根據傳統經驗，將附子按照個頭大小分檔，具有一定的合理性。不同等級附子品質差異主要體現在毒性差異，而在鎮痛活性上差異并不明顯。因此，在充分保障附子減毒效果的前提下，可以考慮將小個頭附子加工成炮制品用于臨床，這有利于節約資源，提高藥材利用率。