螻蛄化學成分及其抗菌活性

劉年珍， 何雨晴，2， 盧辛甜，2， 趙碧清，2?， 周小江，2?

（1.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208；2.湖南省中藥飲片標準化及功能工程技術研究中心，湖南長沙410208）

螻蛄收載于1980 年版《新疆維吾爾自治區藥品標準》，為螻蛄科昆蟲螻蛄Gryllotalpa africana Palisot et Beauvois 的干燥蟲體。螻蛄藥用歷史悠久，始載于《呂氏春秋》，稱為螻蟈， 《神農本草經》 記載“螻蛄味咸性寒，主產難，出肉刺，潰癰腫，下哽噎，解毒，除惡瘡”； 《本草圖經》 記載“利大小便，治口瘡立效”；《本草綱目》 記載螻蛄“利大小便，通石淋，治瘰疬，骨鯁”； 《千金方》 記載“塞耳治聾”［1］。螻蛄在臨床上主要用于治療腎炎、大小便不通、水腫、肝硬化腹水癥、尿 潴 留、 泌 尿 系 統 結 石、 癰 腫、 瘰 疬、 惡 瘡等［1-3］。其水提液具有利尿和鎮靜作用［4］。其主要含有蛋白質、氨基酸、脂肪酸、甾醇、生物堿等成分［5-8］。

螻蛄作為動物類中藥，其臨床療效較好，但對其成分研究不多。為了詮釋其作用物質基礎，特對其化學成分及抗菌活性進行研究，從中分離得6 個化合物，所有化合物均為首次從螻蛄中分離得到，其中化合物4～5 為其抗菌活性成分。

1 材料

Bruker DRX-600 MHz 核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司，TMS 為內標）；高效液相色譜儀（日本島津公司）；Büchi 型旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公 司）； Sephadex LH-20 （美 國 Amersham Biosciences 公司）；Rp-18 反相硅膠（40 ～63 μm，日本Daiso 公司）；D101 大孔吸附樹脂（天津允開公司）；色譜硅膠（200 ～300 目）、硅膠H 和薄層色譜硅膠GF254（青島海洋化工廠）。所用試劑均為分析純。

供試菌株為真菌薯蕷炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides，由海南大學熱帶農林學院薯蕷課題組提供。

螻蛄藥材購買自湖南振興中藥飲片實業有限公司，經湖南中醫藥大學中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為螻蛄科昆蟲螻蛄Gryllotalpa africana Palisot et Beauvois 的干燥蟲體。標本存放在湖南中醫藥大學含浦校區二號實驗樓C 棟427 室。

2 提取與分離

螻蛄藥材10 kg 加6 倍量70%乙醇回流提取3次，1 h／次，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇并濃縮，得濃縮液。將濃縮液加于已用蒸餾水平衡好的大孔吸附樹脂 （HP-20） 柱上， 分別用30%、50%、70%、90%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，合并70%、90%乙醇洗脫液，減壓回收乙醇并濃縮，得浸膏約60 g。浸膏拌樣，加于正相硅膠柱色譜柱上，石油醚-乙酸乙酯-甲醇（70 ∶30 ∶0～70 ∶30 ∶35） 梯度洗脫，收集洗脫液，每份約500 mL，檢識，合并成5 部分（Fr.1～Fr.5）。

Fr.3（4.8 g） 過MCI 柱，甲醇-水梯度洗脫，檢識，合并成3 部分 （Fr.3-1 ～Fr.3-3）。Fr.3-2（0.4 g） 經Sephadex LH-20 凝膠柱和高效液相色譜［甲醇-水（78 ∶22） ］，得化合物6 （4.3 mg）。Fr.3-3（1.3 g） 過Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，甲醇洗脫，檢識，合并成4 部分（Fr.3-3-1 ～Fr.3-3-4），Fr.3-3-1（0.08 g） 經高效液相色譜［甲醇-水（59 ∶41） ］， 得化合物3 （2.5 mg）。 Fr.3-3-2（0.14 g） 經制備薄層（PTLC） ［三氯甲烷-丙酮（1 ∶5） 為展開劑］ 和高效液相色譜 ［甲醇-水（62 ∶38） ］， 得化合物1 （2.1 mg）。 Fr.3-3-4（0.19 g）經制備薄層（PTLC） ［石油醚-乙酸乙酯（10 ∶3） 為展開劑］ 和高效液相色譜［甲醇-水（58 ∶42） ］，得化合物5（4.0 mg）。Fr. 4（7.5 g）過MCI 柱色譜，甲醇-水梯度洗脫，檢識，合并成2 部分（Fr.4-1、Fr.4-2）。Fr.4-2（2.1 g） 先過正相硅膠柱色譜［石油醚-乙酸乙酯梯度（4 ∶1 ～1 ∶2）洗脫］，再經高效液相色譜［甲醇-水（76 ∶24） ］，得化合物4（10.2 mg） 和2（3.0 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：紅色固體，易溶于三氯甲烷、甲醇， 硫 酸-乙 醇 顯 黃 色。1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：8.02（1H，d，J=8.7 Hz，H-8），7.48（1H，s，H-4），7.22（1H，d，J=2.5 Hz，H-5），6.91（1H，dd，J=8.7，2.5 Hz，H-7），5.15（1H，d，J=7.7 Hz，H-1′），2.23（3H，s，CH3）； 13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：187.9（C-9），185.3（C-10），164.9（C-1），163.2（C-6），161.7（C-3），137.3（C-4a），134.1（C-10a），130.9（C-8），125.1（C-8a），124.9（C-7），120.0（C-2），117.9（C-5），112.9（C-9a），106.3（C-4），101.7（C-1′），78.4 （C-5′），78.2 （C-3′），75.0 （C-2′），71.1（C-4′），62.3（C-6′），8.5（-CH3）。以上數據與文獻［9］ 一致，故鑒定為2-甲基-1，6-二羥基蒽醌-3-O-β-葡萄糖苷。

化合物2：淺黃色固體，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯黃色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：8.15（1H，d，J=8.5 Hz，H-8），7.51（1H，d，J=2.6 Hz，H-5），7.22（1H，s，H-4），7.16（1H，dd，J=8.6，2.6 Hz，H-7），2.15（3H，s，CH3）； 13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：187.8（C-9），184.2（C-10），165.0（C-3），164.3（C-1），163.8（C-6），137.2（C-10a），133.9（C-4a），130.7（C-8），127.0（C-8a），122.3（C-7），119.6（C-2），113.9（C-5），110.6（C-9a），108.2（C-4），8.3（-CH3）。以上數據與文獻［10］ 一致，故鑒定為2-甲基-1，3，6-三羥基蒽醌。

化合物3：淺黃色固體，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯黃色。 1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.98（1H，d，J=8.7 Hz，H-8），7.42（1H，s，H-4），7.27（1H，d，J=2.5 Hz，H-5），6.85（1H，dd，J=8.8，2.5 Hz，H-7），5.39（1H，d，J=7.6 Hz，H-1′），5.37（1H，d，J=2.1 Hz，H-1″），2.22（3H，s，CH3），1.16（3H，d，J=6.2 Hz，rham-CH3）； 13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：187.8（C-9），185.7（C-10），163.2（C-1），163.1（C-6），161.1 （C-3）， 137.3 （C-4a）， 134.0 （C-10a），131.1（C-8），125.8（C-8a），122.8（C-7），120.8（C-2），112.8（C-5），111.6（C-9a），105.8（C-4），102.5（C-1″），99.6（C-1′），79.7（C-5′），79.3（C-3′），78.2（C-2′），74.1（C-4″），72.5（C-2″），72.2 （C-3″），71.3 （C-4′），70.3 （C-5″），62.9（C-6′），18.4（C-6″），9.3（-CH3）。以上數據與文獻［9］ 一致，故鑒定為2-甲基-1，6-二羥基蒽醌-3-O-β-葡萄糖-（2′→1″） -α-鼠李糖苷。

化合物4：淺黃色固體，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯紫紅色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：9.77（1H，s，H-8），8.69（1H，s，H-13），8.11（1H，d，J=9.0 Hz，H-11），7.99（1H，d，J=8.9 Hz，H-12），7.65（1H，s，H-1），6.96（1H，s，H-4），6.11（2H，s，-OCH2O），4.92（2H，t，J=5.4 Hz，H-6），4.20（3H，s，9-OCH3），4.10（3H，s，10-OCH3），3.25（2H，t，J=5.4 Hz，H-5）； 13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：152.3（C-10），152.2（C-3），150.1（C-2），146.5（C-9），145.8（C-8），139.8（C-13a），135.3（C-12a），132.0（C-4a），128.0（C-11）， 124.5 （C-12）， 123.4 （C-8a），122.0（C-13b），121.5 （C-13），109.4 （C-4），106.6（C-1），103.7（-OCH2O），62.6（9-OCH3），57.6（10-OCH3），57.2（C-6），28.2（C-5）。以上數據與文獻［11］ 一致，故鑒定為小檗堿。

化合物5：淺黃色固體，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯紫紅色。 1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：9.78（1H，s，H-8），8.82（1H，s，H-13），8.13（1H，d，J=9.1 Hz，H-11），8.02（1H，d，J=9.0 Hz，H-12），7.68（1H，s，H-1），7.06（1H，s，H-4），4.91（2H，t，J=5.4 Hz，H-6），4.21（3H，s，9-OCH3），4.12（3H，s，10-OCH3），3.99（3H，s，2-OCH3），3.95（3H，s，3-OCH3）3.31（2H，t，J=5.4 Hz，H-5）； 13C-NMR（150 MHz，CD3OD） δ：154.0（C-3），152.1（C-10），151.1（C-2），146.6（C-8），145.9（C-9），140.0（C-13a），135.4（C-12a），130.2（C-4a），128.2（C-12），124.6（C-11），123.5（C-13b），121.4（C-13），120.6（C-8a），112.3（C-4），110.0（C-1），62.7（9-OCH3），57.7 （10-OCH3）， 57.3 （2-OCH3）， 57.0 （3-OCH3），56.7（C-6），27.8（C-5）。以上數據與文獻［12］ 一致，故鑒定為巴馬汀。

化合物6：淺黃色固體，易溶于丙酮、甲醇，硫酸-乙醇顯黃色。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：8.12（1H，d，J=8.7 Hz，H-8），7.50（1H，d，J=2.5 Hz，H-5），7.42（1H，s，H-4），7.18（1H，dd，J=8.7，2.5 Hz，H-7），5.42（1H，d，J=7.6 Hz，H-1′），5.39（1H，d，J=2.1 Hz，H-1″），2.23（3H，s，-COCH3），1.97（3H，s，2-CH3），1.17（3H，d，J=6.2 Hz，H-6″）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：187.8（C-9），185.6（C-10），181.0（-COCH3），163.2（C-1），161.1（C-6），161.1（C-3），137.3（C-4a），134.0（C-10a），131.1（C-8），131.1（C-8a），122.8（C-7），117.0（C-2），112.8（C-5），112.8（C-9a），105.9（C-4），102.5（C-1″），99.6 （C-1′），79.7 （C-3′），79.3 （C-2′），78.3（C-5′），74.1（C-4″），72.9（C-2″），72.5（C-3″），72.2 （C-4′），71.3 （C-5″），70.3 （C-6′），21.8（-COCH3），18.3（C-6″），9.3（-CH3）。以上數據與文獻［10］ 一致，故鑒定為2-methyl-1，6-dihydroxy-9，10-anthraquinone-3-O-（6′-O-acetyl） -α-L-rhamnosyl-（1″→2′） -β-D-glucoside。

4 抗菌活性篩選

4.1 方法［13］

4.1.1 抑菌活性 陽性對照品為放線菌酮，空白對照品為色譜甲醇。供試菌株由于低溫（-10 ℃）保存，在活性檢測前需進行活化。制備土豆固體培養基并滅菌制成平板備用，挑取供試菌株菌絲體置于培養基中，于25 ℃無菌室中靜置48 h。制備土豆液體培養基并滅菌置于離心管中備用，挑取已活化的菌絲體置于離心管中，于搖床上（25 ℃，暗處） 振搖24 h。將已制備好的菌液用滅菌棉簽均勻涂板，用鑷子夾取直徑6 mm 的無菌濾紙片放在平板中浸泡。將所得化合物和放線菌酮分別用甲醇溶解并配成1 mg／mL 溶液。各吸取10 μL 置于濾紙上，密封后于25 ℃無菌室中靜置48 h 后觀察。

4.1.2 最小抑菌濃度 采用96 孔板法，將化合物4 ～5 分別配成1 mg／mL 溶液， 吸取640 μL 加360 μL甲醇定容至640 μg／mL，質量濃度依次呈0.5 倍梯度稀釋10 次至1.25 μg／mL，用空白培養基和甲醇溶液作對照，制備土豆液體培養基并滅菌備用。將稀釋好的樣品和對照品分別吸取10 μL 置于已加入10 μL 培養液的96 孔板中。密封后于25 ℃無菌室中靜置48 h 后觀察。

4.2 結果

4.2.1 抑菌活性 實驗結果見圖1。結果表明，化合物4～5 具有一定的抑菌活性。

圖1 抑菌實驗結果Fig.1 Results of bacteriostasis experiment

4.2.2 最小抑菌濃度 結果顯示，化合物5 在640 μg／mL 以下無明顯抑菌活性， 化合物4 在320 μg／mL 以上有一定的抗病原真菌薯蕷炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides 活性，化合物4 最小抑菌濃度為320 μg／mL。

5 討論

本研究首次從螻蛄中分離和鑒定了4 種蒽醌類和2 種生物堿類成分，且化合物4 ～5 為抗菌活性成分，這為研究其臨床治療腎炎等的物質基礎奠定了基礎。動物藥主要含有蛋白質等大分子類成分［14-15］，本實驗針對小分子化合物進行研究，并找出具有抗菌活性的小分子化合物，以期豐富動物藥的研究思路。螻蛄為動物藥，本研究從中發現了蒽醌類和生物堿類成分，并且有小檗堿和巴馬汀，推測這些化合物與其食物來源相關。