基于網絡藥理學左金丸治療胃潰瘍的機制

卜雕雕， 蘇 卓， 張 丹， 柏希慧， 王昌利

（陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽712046）

左金丸源自《丹溪心法》，由吳茱萸、黃連（6 ∶1） 組成，前者功效散寒止痛、降逆止嘔，屬于熱性藥；后者功效清熱瀉火解毒，屬于寒性藥。臨床常將兩者配伍使用，兩藥一辛一苦、一熱一寒、一升一降，相輔相成共同發揮藥效，組成左金丸后具有清熱瀉火解毒、降逆止嘔、散寒止痛功效［1］。現代藥理學研究對左金丸的研究較少，主要集中在 慢 性 胃 炎［2］、 胃 腸 疾 病［3］、 消 化 道 潰瘍［4］等，以抗潰瘍為主。其中，胃潰瘍屬于消化性潰瘍，是指在胃角、賁門、胃竇和裂孔疝等部位發生的潰瘍，其致病因素包括胃酸增多、黏膜破壞、遺傳、飲食、藥物、吸煙、全身性疾病、精神疾病等。

中藥普遍有多成分、多靶點的特點，導致研究其治病機制時存在困難。2007 年，英國藥理學家Hopkins 首次提出“網絡藥理學” 的概念［5］，它對藥物-藥物、藥物-疾病網絡進行分析，不局限于單一成分、單一靶標、單一疾病，可闡明中藥“多組分-多成分-多靶點-多環節” 的特點，對中醫藥現代化發展產生積極推動作用［6］。因此，本研究采用網絡藥理學對左金丸治療胃潰瘍的機制進行研究，為其發揮臨床療效提供了依據。

1 材料與方法

1.1 成分收集 在中藥系統網絡藥理學數據庫和分析平臺［7］（TCMSP，http： ／／lsp. nwu. edu. cn／tcmsp.php） 輸入“吳茱萸” “黃連” 收集兩者成分，選擇口服生物利用度（OB） ≥30%和藥物相似性（DL） ≥0.18 者作為篩選出的活性成分［8］。在ChemDraw Pro 16.0 中畫出活性成分結構式，保存為MDL Molfile（. mol） 格式，利用OpenBabel軟件中的convert 功能將上述格式轉化為Sdf-MDL MOL format 備用［9］。

1.2 活性成分靶點預測 進入Swiss Target Prediction （http： ／／www. swisstargetprediction. ch／） 數據庫，在繪圖區粘貼上述Sdf-MDL MOL format 格式文件，點擊Import-Predict the target 即可輸出化合物靶點信息［10］。在數據庫搜索的藥物靶點命名存在不規范問題，故把所有靶點導入UniProt（https： ／／www.uniprot.org／） 數據庫中，輸入靶點蛋白名稱限定物種為“Homo sapiens”，將所有蛋白名稱均校正為其官方名稱（official symbol）。將所得吳茱萸、黃連主要活性成分的靶點與pharm GKB（https： ／／www. pharmgkb. org／）、CTD（http： ／／ctdbase. org／）、 GeneCards （https： ／／www.genecards.org／） 數據庫中查詢到的與胃潰瘍有關的靶點比對分析，篩選左金丸治療胃潰瘍可能潛在的靶點。

1.3 靶點類型歸屬 DisGeNET （http： ／／www.disgenet.org／web／DisGeNET／menu／search） 是一個包含與人類疾病相關的基因和變體集合的公開數據庫，將“1.2” 項下潛在靶點輸入DisGeNET，得到靶點類型（Protein Class）。

1.4 蛋白-蛋白相互作用網絡構建 將所得左金丸作用靶點導入string 數據庫 （https： ／／string-db.org／）［11］，選擇Multiple protein， 限定物種為人，得到蛋白相互作用，導出node1、node2、Combined score 值導入cytoscape 軟件，并設置節點大小及顏色反應degree 值、score 值，最終得到蛋白互作網絡圖。

1.5 GO 功能、KEGG 通路富集分析 將30 個左金丸治療胃潰瘍的潛在靶點通過cytoscape 的ClueGO 插件進行GO 生物學功能分析，將靶點輸入DAVID（database for annotation，visualization and integrated discovery） 進行KEGG 通路分析。以P＜0.05 為篩選條件，得到相關分析結果。

1.6 左金丸活性成分-靶點-通路網絡構建 采用cytoscape3.6.1 軟件中的Merge 功能，構建藥材-活性成分-靶點-通路網絡圖。其中，節點（node） 代表藥材、活性成分、靶點和信號通路，邊（edge）用來連接單味藥、活性成分、靶點和信號通路。

1.7 分子對接驗證 選擇上述網絡圖中度值排名前5 的靶點，查找其PDB ID，輸入systems Dock Web Site（http： ／／systemsdock.unit.oist.jp／iddp／home／index） 中與左金丸治療胃潰瘍的活性成分進行分子對接，保存結果，用其Docking Score 評價化合物和靶點的結合活性。

2 結果

2.1 左金丸活性成分篩選 通過TCMSP 搜索到吳茱萸176 種活性成分，其中OB≥30、DL≥0.18 的共30 種； 黃連48 種活性成分， 其中OB ≥30、DL≥0.18 者共14 種。去除重復成分，最終得到41 種，具體見表1。

2.2 左金丸活性成分靶點信息、 靶點類型歸屬 將潛在活性成分的Sdf-MDL MOL format 格式文件上傳到Swiss Target Prediction 數據庫，預測吳茱萸和黃連活性成分的靶點，41 種活性成分對應615 個靶點，去除重復的靶點后還剩余228 個。再應用pharm GKB、CTD、GeneCards 數據庫搜索與胃潰瘍（Gastric ulcer） 相關的靶點，與上述228個靶點比對分析后，得到30 個治療胃潰瘍的潛在作用靶點，見表2，可知一個靶點可對應多種化學成分，如TDP1 （14 個）、 CDK1 （8 個）、 CDK2（8 個）、CYP2D6（7 個）、ADRA2A（6 個） 等頻數較高。然后，將30 個靶點輸入DisGeNET 數據庫，得到靶點類型的信息（表2），包括酶（水解酶、氧化還原酶、轉移酶、連接酶、激酶、蛋白酶等）、轉運體、轉錄因子、受體、核酸結合等，表明左金丸能通過不同靶點類型發揮藥效。

2.3 左金丸潛在靶點之間作用分析 利用string數據庫和cytoscape 軟件得到靶點相互作用網絡圖，見圖1。由圖可知，該網絡圖中只用24 個靶點，其余靶點之間無相互作用，故網絡圖中未顯示；包含24 個節點、55 條邊，degree 值越大，節點越大，而Combine score 值越大，邊越粗，其中具有較大度 值 （degree ≥7） 的 蛋 白 質 為 HSP90AA1、PTGS2、NOS3、MMP9，表明左金丸治療胃潰瘍可能通過多個靶點聯合共同發揮作用。

2.4 靶點生物學功能注釋 通過cytoscape3.6.1的ClueGo 插件對左金丸治療胃潰瘍潛在靶點進行GO 生物學功能分析，結果見圖2，可知左金丸治療胃潰瘍的藥效機制可能與神經遞質代謝過程、四吡咯結合、血紅素結合、神經遞質等有關。GO 屬于基因功能分類體系，有3 個分支， 即生物過程、分子功能、細胞組分，而左金丸治療胃潰瘍的靶點在生物過程中主要富集到氧化還原過程、鈣離子轉運負調控、精氨酸分解過程等；細胞組成中富集到細胞器膜、細胞質膜、管基底等離子體膜等；分子功能中富集到血紅素結合、一氧化氮合酶活性、鐵離子結合等生物學過程，即涉及多個生物學過程。

表1 左金丸活性成分Tab.1 Active components of Zuojin Pills

表2 左金丸活性成分潛在靶點Tab.2 Potential targets for active components of Zuojin Pills

圖1 左金丸潛在靶點之間相互作用網絡圖Fig.1 Network diagram of interactions among potential targets for Zuojin Pills

2.5 靶點通路注釋分析 圖3 顯示，13 個通路被富集，其中新陳代謝、氨基酸代謝通路2 條，包括Arginine biosynthesis、 Arginine and proline metabolism；新陳代謝、脂質代謝通路1 條，包括Arachidonic acid metabolism；新陳代謝、外源性物質生物降解和代謝通路1 條，包括Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450；人類疾病、癌癥通路4 條，包括Pathways in cancer、Chemical carcinogenesis、Small cell lung cancer、Prostate cancer；有機系統、內分泌系統通路2 條，包括Ovarian steroidogenesis、 Progesterone-mediated oocyte maturation；有機系統、神經系統通路1 條，包括Serotonergic synapse；環境信息處理、信號轉導通路1 條，包括Calcium signaling pathway，表明左金丸治療胃潰瘍活性成分的靶點分布在多個通路中，從而協調發揮治療作用。

圖2 GO 生物學功能分析Fig.2 GO biological function analysis

圖3 KEGG 通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 藥材-成分-靶點-通路圖 采用cytoscape 軟件的merge 功能構建藥材-成分-靶點-通路網絡圖，見圖4。由圖可知，該網絡有67 個節點（包括2 味中藥、32 種成分、20 個靶點、13 條通路） 和149條邊，節點越大，度越大，與其相連的節點數越多，其中吳茱萸次堿、β-谷甾醇、谷甾醇、槲皮素、廣 玉 蘭 內 酯、 1-（5， 7， 8-trimethoxy-2， 2-dimethylchromen-6-yl） ethanone、icosa-11，14，17-trienoicacidmethylester、31-去甲基-9（11） -羊毛甾烯醇等度值較大，表明其作用靶點多。另外，靶點節點越大，靶點度越大，與其相連的成分越多，而圖4 中PTGS2、CDK1、CDK2、NOS3、SLC6A4 等靶點節點較大，可能為藥物作用的靶點。

圖4 藥材-成分-靶點-通路圖Fig.4 Medicinal material-component-target-pathway diagram

2.7 分子對接 將圖4 中度值排名前5 的靶點CDK2 （PDB ID： 2R3I）、 PTGS2 （PDB ID：1Q4G）、CDK1（PDB ID：1X8B）、CYP2D6（PDB ID：1Z10）、HSD11B1（PDB ID：1XU9） 與41 種成分進行分子對接， 結果見表3。 由表可知，docking score＞7 的有28 種（13.7%），介于5～7 的有129 種 （62.9%）， 介于4.25 ～5 的有24 種（11.7%），小于4.25 的有24 種（11.7%），由于大于4.25 時表示藥物分子與靶蛋白間存在結合能力，大于5.0 時表示結合活性較強，大于7.0 時表示結合能力極強［12］，而本研究中大于4.25 者占總數88.3%，即大部分靶點與成分的結合活性較好。

3 討論

左金丸常用于肝火犯胃證，臨床用于治療胃潰瘍、慢性胃炎等。方中黃連、吳茱萸含多種藥效成分，例如小檗堿對胃腸運動作用具有促進作用，對胃腸黏膜具有較好的保護作用［13］；吳茱萸次堿具有濃度依賴性的肌肉松弛作用［14］，并且吳茱萸次堿能降低乙酰水楊酸誘導的大鼠胃潰瘍的胃潰瘍指數，對于血漿中CGRP（降鈣素基因的相關肽） 濃度具有明顯的強作用，并能被辣椒素受體阻斷劑capsazepine（一種競爭性辣椒素受體拮抗劑） 阻斷，表明該成分對胃黏膜的保護作用可能是通過激動辣椒素受體，從而對內源性CGRP 釋放起到促進作用［15］。楊炳友等［16］證實，吳茱萸多糖、吳茱萸內酯對胃潰瘍有較好的治療效果，隨著劑量加大其抗潰瘍作用也隨之增強，而且兩者可協同降低胃蛋白酶活性；黃連素抗菌譜廣，能殺滅幽門螺旋桿菌，同時可抑制胃酸分泌，對胃潰瘍有一定的治療效果［17］；李備［18］證實，黃連及其所含的生物堿可抑制胃酸分泌，改善胃黏膜血流供應，提高胃黏膜屏障功能，調節神經體液，抑制致炎因子產生，抗脂質過氧化，從而保護胃黏膜，可作為治療消化性潰瘍的藥物。另外，黃連、吳茱萸按不同比例配伍后的藥效均比單味藥強，可抑制胃酸與胃蛋白酶活性，從而使胃黏液分泌增加，減輕攻擊因子對胃黏膜的損傷，從而增強“胃-黏液-碳酸氨鹽” 的屏障作用［19］。

本研究在GO 生物學過程富集分析時發現，左金丸治療胃潰瘍的基因在生物學過程中主要富集到氧化還原過程、鈣離子轉運負調控、精氨酸分解過程等；細胞組成富集到細胞器膜、細胞質膜、管基底等離子體膜等；分子功能包括血紅素結合、一氧化氮合酶活性、鐵離子結合等生物學過程。前期報道，左金丸可通過抑制乙酰膽堿來引起Ca2+濃度的升高，從而進一步抑制牛腎上腺髓質細胞分泌兒茶酚胺，后者過量時會引起胃黏膜血管萎縮，使黏膜血液流動緩慢，誘發黏膜缺血和缺氧，最終導致潰瘍產生［20］；還可提高胃液pH 值，對胃黏膜攻擊因素具有降低作用，使其防御功能增強，促進胃潰瘍愈合，最終有效預防大鼠胃潰瘍［21-22］。另外，NO 屬于神經遞質和信使分子，可發揮多種生物學效應，在正常生理狀態下，少量NO 對胃黏膜微循環和黏液分泌具有調節作用，進而保護胃黏膜；在病理狀態下， 過量NO 會引起正常基因發生突變［23］，與本研究結果吻合。

表3 分子對接結果Tab.3 Results of molecular docking

KEGG 通路富集分析時，富集到13 條P＜0.05者，其中5-羥色胺突觸、花生四烯酸代謝、癌癥途徑等通路與胃潰瘍相關。林科名等［24］證實，左金丸可調節多種神經遞質，降低應激性胃潰瘍大鼠的腦、腎上腺組織中去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA） 等單胺類神經遞質濃度，其發揮抗應激性胃潰瘍的作用機制是通過神經體液途徑來實現的；花生四烯酸主要代謝產物是前列腺素 （PGs），具有保護胃黏膜的作用， 其中PGE2具有多種生物學功能，是局部保護胃黏膜的保護因素，一方面PGE2能使胃黏膜血流量、血管通透性、腺體黏液分泌增加，進而使局部黏膜屏障功能增強［25］；另一方面能促進胃黏膜上皮細胞再生，誘導黏膜基底細胞向表面移行，進而對潰瘍面自身修復起到促進作用［26］，與本研究結果吻合。

綜上所述，本研究構建左金丸“藥材-成分-靶點-信號通路” 網絡圖，其中包括2 味中藥、32 種成分、20 個靶點、13 條信號通路，其中吳茱萸次堿、icosa-11，14，17-trienoic acid methyl ester、槲皮素、廣玉蘭內酯等均有較大度值，可能是抗胃潰瘍的關鍵成分； 重組人周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）、前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、周期素依賴性激酶1 （CDK1）、細胞色素P450 2D6（CYP2D6）、人皮質類固醇11β 脫氫酶同工酶1（HSD11B1） 在眾多靶點中擁有較高度值；5-羥色胺突觸、花生四烯酸代謝、癌癥途徑等通路是發揮抗胃潰瘍作用的主要潛在信號通路。由此可知，左金丸主要活性成分通過調控多個靶點、多個信號通路來發揮抗胃潰瘍的作用，即有著“多成分-多靶點-多通路” 的特點，可為今后驗證該制劑具體作用靶點和信號通路提供依據。