人參皂苷Rg1 對糖尿病大鼠勃起功能障礙的影響

夏雨果， 陳 秋， 高 坪， 曾文彤， 張 闖， 胡臣玲

（1.成都中醫藥大學臨床醫學院／附屬醫院泌尿外科，四川 成都610072；2. 成都中醫藥大學附屬醫院內分泌科，四川 成都610072）

勃起功能障礙是糖尿病常見的并發癥［1］，是影響患者生活質量及家庭和諧的重要因素，其發病機制不明，缺乏有效的預防及治療措施。中醫對勃起功能障礙有獨特療效，本實驗研究人參皂苷Rg1對糖尿病大鼠勃起功能障礙的影響，并探討其作用機制，為患者治療提供新思路。

1 材料

清潔級雄性SD 大鼠，約6 ～7 周齡，體質量200～350 g，由成都達碩生物科技有限公司提供，實驗經成都中醫藥大學附屬醫院倫理委員會批準。人參皂苷Rg1（成都普瑞法科技開發有限公司）；西地那非片 （美國輝瑞公司）；Trizol （美國Invitrogen 公司）； 鏈脲佐菌素 （STZ）、 阿撲嗎啡（APO）、焦碳酸二乙酯（DEPC） （美國Sigma 公司），PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex Taq II Kit［寶生物工程（大連） 有限公司］；實時熒光定量儀（美國Thermo Fisher 公司），引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。大鼠一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶 （SOD）、丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司）；SIRT1、eNOS；β-actin 抗體（美國Affinity 公司）；濃縮型DAB 試劑盒、羊抗兔二抗（北京中衫金橋生物有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；蛋白Marker（美國NEB 公司）；ECL 發光試劑盒（美國Thermo公司）；聚偏二氟乙烯（PVDF） 膜（美國Hybond公司）；大鼠ICP／MAP 測定采用BL-420 生物機能實驗系統（成都泰盟科技有限公司）；免疫組化采圖及分析采用Image-Pro Plus 6.0（美國Media Cybernetics 公司）。

2 方法

2.1 模型建立 90 只大鼠在SPF 環境下適應性飼養1 周后測定隨機血糖，作為基線，隨機選取10只作為正常組，其余80 只作為實驗組。實驗組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素誘導1 型糖尿病，劑量60 mg／kg；正常組大鼠腹腔注射等量生理鹽水以減少實驗誤差，注射后7 d 取尾靜脈血測定隨機血糖，以其＞16.7 mmol／L 作為成模標準［2］，未成模者補充注射1 次鏈脲佐菌素，劑量30 mg／kg，注射后3 d再按以上標準篩選模型。糖尿病大鼠飼養10 周后，參照Heaton［3］報道的方法篩選，將阿撲嗎啡按100 μg／kg 劑量皮下注射于大鼠頸部皮膚，觀察30 min，記錄有無勃起及勃起次數，未勃起者為勃起功能障礙，勃起標準為龜頭露出充血，包皮后退，陰莖膨大增長。

2.2 分組及給藥 注射鏈脲佐菌素后4 只大鼠無法誘導成糖尿病，同時糖尿病大鼠喂養期間死亡7只，最終篩選出56 只。原有正常組不變，將篩選成功的大鼠隨機分為4 組，每組14 只，分別為正常組、模型組（灌胃等量生理鹽水）、人參皂苷Rg1低劑量組（灌胃15 mg／kg） 和高劑量組（灌胃30 mg／kg）、西地那非組（灌胃5 mg／kg）。給藥2、4 周， 測定大鼠體質量及血糖，4 周后測定ICP／MAP 以評估勃起功能，完成后取大鼠陰莖組織，進行病理學及分子生物學檢測。

2.3 陰莖海綿體內壓 （ICP） 及平均頸動脈壓（MAP） 測定 各實驗組大鼠給藥4 周后測定ICP／MAP，測定前24 h 停止給藥，測定當天早上禁食，予以10%水合氯醛（3 mL／kg） 麻醉，常規消毒鋪巾，暴露頸總動脈，將22 號蝶形插管插入頸總動脈并固定與生物機能實驗系統以測定MAP 值；解剖分離陰莖，將24 號蝶形針插入陰莖海綿體連接傳感器以測定ICP，再分離出陰莖根部海綿體神經，將生物機能實驗系統的電極鉤住海綿體神經以刺激陰莖勃起，分別測定基礎、勃起狀態下最高ICP 值。

2.4 MDA、NO、SOD 水平檢測 采用ELISA 法。大鼠陰莖組織充分勻漿后， 3 000 r／min 離心15 min，收集上清液，將MDA、NO、SOD 抗體包被于48 孔微孔中制成固相載體，加入對照品或樣品。MDA、NO、SOD 連接于固相載體上的抗體結合，徹底洗滌后加入相應抗體，將未結合的生物素抗體洗凈后，加入辣根過氧化物酶（HRP） 標記的親和素，再次徹底洗滌后加入四甲基聯苯胺底物顯色，它在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下最終轉化成黃色，顏色深淺與3 種因子水平呈正相關。然后，在450 nm 波長下檢測吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

2.5 mRNA 表達檢測 采用qPCR 法。將液氮中保存的陰莖組織按說明書用Trizol 提取總RNA 后，依次加入DNA Eraser Buffer、DNA Eraser、RNase Free dH2O，42 ℃下反應2 min 以去除基因組DNA，將所得RNA 用PrimeScript RT Enzyme Mix I 試劑盒進行逆轉錄反應，反應完成后加入引物進行PCR擴增， 引 物 序 列 為β-actin （正 向5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′，反向5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA） -3′、SIRT1（正向5′-TGGCAGTAACAGTGACAGTGGCACAT-3′， 反 向 5′-TCAGCTCCAGATCCTCCAGCACACTC-3′）， eNOS （正 向5′-AGCTGGATGAAGCCGGTGAC-3′，反向5′-CCTCGTGGTAGCGTTGCTGA-3′）。反應條件為95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃充分延伸并采集熒光30 s，以上反應循環40 次，結果采用2-ΔΔCt法進行分析。

2.6 蛋白表達檢測 采用Western blot 法。取液氮凍存大鼠睪丸組織100 mg，于37 ℃水浴中解凍后按1 ∶10 的比例加入RIPA 裂解液，滅菌后的小剪刀剪碎，碎冰上裂解10 min，收集裂解液并離心，上清液用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將積層膠配制好并加入電泳液，根據所測蛋白濃度加入60 μg 蛋白量至樣孔中進行電泳，電泳結束后按轉膜方法覆蓋PVDF 膜，接通電源調整至電流至200 mA 轉膜1 ～2 h，然后依次封閉，一抗孵育過液，其中一抗濃度按eNOS 1 ∶1 000、SIRT1 1 ∶500、β-actin 1 ∶5 000 的比例進行稀釋，再進行二抗孵育，最后進行顯影、定影、拍照。Quentity One 進行目的條帶分析，目的蛋白相對表達量=目的蛋白積分光密度值（IOD） ／內參積分光密度值（IOD）。

2.7 eNOS 陽性細胞表達檢測 采用免疫組化法。將大鼠陰莖病理切片脫蠟后浸入3%甲醇雙氧水中10 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min，檸檬酸鹽緩沖液加溫至沸騰， PBS 洗凈后加入封閉液浸泡20 min，再加入一抗反應過夜，滴加生物素二抗，37 ℃下反應30 min，PBS 洗滌3 次后DAB 顯色，透明樹膠封片，光鏡下采圖，通過Image-Pro Plus 6.0 軟件進行分析。

2.8 統計學分析 通過SPSS17.0 軟件進行處理，數據用（） 表示，2 組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠體質量與血糖 表1 顯示，建模1 周后各組大鼠體質量無顯著差異（P＞0.05），同時也排除了基線誤差；隨著生長周期的延長，體質量逐漸增加，但正常組更明顯，而在同一時間點實驗組體質量均顯著低于正常組（P＜0.01），但組間無顯著差異（P＞0.05）。表2 顯示，注射鏈脲佐菌素后1周實驗組大鼠血糖顯著高于正常組（P＜0.01），達到糖尿病診斷標準，同時使用人參皂苷Rg1或西地那非后大鼠血糖值均無顯著變化（P＞0.05）。

表1 各組大鼠體質量比較Tab.1 Comparison of rat body weights among various groups

表1 各組大鼠體質量比較Tab.1 Comparison of rat body weights among various groups

注：與正常組比較，??P＜0.01

組別 動物數／只 造模1 周 造模4 周 造模10 周 給藥2 周 給藥4 周正模人人西常型參參地組組皂皂那 苷苷非 組RR gg 11低高劑劑量量組組 11111 04444 22222 34444 95122.....62270 17534±±±±±59565.....36418 16275 32222 95586 05136.....31560 35610±±±±±33354 03765.....75156 86251 ???????? 43332 70009 87317.....38782 98561±±±±±38545 90334.....15169 33126 ????????43222 90878 28241.....96362 43189±±±±±49444 30354.....70855 05938 ???????? 53332 13019 02464.....77983 21492±±±±±48344 10829.....60510 17957????????

表2 各組大鼠血糖比較Tab.2 Comparison of rat blood glucose among various groups

表2 各組大鼠血糖比較Tab.2 Comparison of rat blood glucose among various groups

注：與正常組比較，??P＜0.01

組別 動物數／只 造模1 周 造模4 周 造模10 周 給藥2 周 給藥4 周正模人人西常型參參地組組皂皂那 苷苷非 組RR gg 11低高劑劑量量組組 11111 04444 1211 68087.....36235 72374±±±±±05555.....31839 23304 ????????3323 62191.....57275 97901±±±±±03444.....37341 23140 ???????? 2232 56509.....45107 25135±±±±±08856.....34432 01702 ???????? 2232 58709.....62134 60566±±±±±07825.....44878 06383 ???????? 2322 58066.....74169 63504±±±±±07287.....56808 70898????????

3.2 SOD、MDA、NO 水平 表3 顯示，與正常組比較， 模型組大鼠SOD、 NO 水平顯著降低（P＜0.01），MDA 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，人參皂苷Rg1高劑量組SOD、NO水平顯著升高（P ＜0.05），MDA 水平顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組SOD、MDA、NO 水平比較Tab.3 Comparison of SOD，MDA and NO levels among various groups

表3 各組SOD、MDA、NO 水平比較Tab.3 Comparison of SOD，MDA and NO levels among various groups

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01，；與模型組比較，△P＜0.05

組別 動物數／只 SOD／（ng·mL-1） MDA／（nmol·mL-1） NO／（μmol·mL-1）正模人人西常型參參地組組皂皂那 苷苷非 組RRgg 11 低 高劑劑量量組組 11111 04444 22222.....40130 77349 42666±±±±±00000.....11211 74191 56666 ??△???? 11111.....57656 13266 44020±±±±±00000.....01101 50284 35502 ?△??96677.....34979 91752 00268±±±±±01100.....42098 98783 19872??????△△

3.3 ICP／MAP 表4 顯示，與正常組比較，模型組ICP／MAP 顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，人參皂苷Rg1組ICP／MAP 顯著升高 （P ＜0.05，P＜0.01），以高劑量組更明顯。

表4 各組ICP／MAP 比較（，1 mmHg=0.133 kPa）Tab.4 Comparison of ICP／MAP among various groups（，1 mmHg=0.133 kPa）

表4 各組ICP／MAP 比較（，1 mmHg=0.133 kPa）Tab.4 Comparison of ICP／MAP among various groups（，1 mmHg=0.133 kPa）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 動物數／只 MAP／mmHg 勃起前ICP／mmHg 勃起后ICP／mmHg （ICP／MAP）／%正模人人西常型參參地組組皂皂那 苷苷非 組RRgg 11 低高劑劑量量組組 11111 04444 11111 22222 41244.....39933 6880±±±± ±8 423.6...5.56578 738 9 21111 81123.....85920 2660±±±± ±3 322.3...7.29666 6568?? ?????? 10 3466 65855.....44237 222±±±±±87 126..3..17.7611 685???? ????△△ △△△ 82355 59922.....30147 57978±±±±±72544.....87086 02927????????△△△△ △

3.4 SIRT1、eNOS mRNA 表達 圖1 顯示，與正常組比較，模型組SIRT1、eNOS mRNA 表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，人參皂苷Rg1高劑量組兩者mRNA 表達顯著升高（P＜0.05）。

圖1 各組SIRT1、eNOS mRNA 表達Fig.1 mRNA expressions of SIRT1 and eNOS in various groups

3.5 SIRT1、eNOS 蛋白表達 圖2 顯示，與正常組比較，模型組SIRT1、eNOS 蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，人參皂苷Rg1高劑量組兩者蛋白顯著升高，其表達量顯著高于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。

圖2 各組SIRT1、eNOS 蛋白表達Fig.2 Protein expressions of SIRT1 and eNOS in various groups

3.6 eNOS 分布 圖3 顯示，eNOS 陽性細胞主要分布于血管周圍內皮細胞，位于細胞漿；與正常組比較，模型組eNOS 平均光密度值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，人參皂苷Rg1高劑量組其平均光密度值顯著升高（P＜0.05）。

4 討論

勃起功能障礙是指多種原因造成的陰莖海綿體血液充盈不足，導致陰莖持續不能達到或維持足夠勃起以完成并維持滿意的性交，是影響眾多男性健康和家庭幸福的常見疾病。隨著生活水平及方式的改變，糖尿病發病率逐年升高，并且發病年齡呈年輕化趨勢， 也成為勃起功能障礙重要原因之一［4-5］，其發病機制可能與糖尿病患者在長期高血糖環境下引起的氧化應激損傷有關，氧化應激所產生的ROS、MDA、8-OHdG 等氧化應激產物損傷血管內皮細胞，影響內皮細胞釋放NO 等因子，甚至引起血管內皮細胞凋亡，患者陰莖血管病變導致血管壁彈性纖維的糖基化反應，使海綿體竇狀血管舒張能力降低，從而影響陰莖勃起功能［6］。目前，治療糖尿病勃起功能障礙的方法除了控制飲食和血糖外，其余與普通勃起功能障礙類似，主要以經典的PDE5 抑制劑（5 型磷酸二酯酶抑制劑） 為主，如他達那非、西地那非等，此類藥物短期療效較好，但長期療效不理想，而且其心血管副作用及部分患者憂慮導致接受度不高，故亟需開發有效的天然藥物。

圖3 各組eNOS 免疫組化分析（IHC×400）Fig.3 Analysis of eNOS immunohistochemistry in various groups（IHC×400）

中醫認為，糖尿病屬中醫“消渴” 范疇，病久引起陽痿［7］，其成因歷代均主張為腎虛，由此也形成了以治腎為主的辨治理論［8］，而治腎又以腎氣、腎精為著手點，如人參、杜仲、淫羊霍、鹿茸等藥材成為常用中藥。其中，人參味甘、微苦，性微溫，具有益氣補中、生津止渴等功效，被用于治療消渴病，人參皂苷Rg1是其主要有效成分之一，有明顯的抗氧化及保護血管內皮細胞功能，可降低氧化應激產物生成，提高機體抗氧化活性，減少糖尿病并發癥發生［9］。課題組前期證明，改善陰莖血管內皮細胞功能可保護勃起功能，將攜帶多效生長因子（PTN） 基因的脂肪干細胞注射進勃起功能障礙大鼠的陰莖海綿體1 周后，即能檢測到該基因高表達，勃起功能得到有效恢復［10］； 文獻［11］ 報道，人參皂苷Rg1可通過PI3K-Akt 信號通路來促進eNOS mRNA 表達，增加NO 生成，從而達到抗心肌缺血的作用，而且能顯著降低糖尿病大鼠血糖，改善血脂代謝紊亂，提高肝臟及外周組織胰島素敏感性，改善胰島素抵抗［12］；由于該成分常用劑量為10 ～40 mg／kg［13］，故本實驗選擇15、30 mg／kg 進行研究，發現其劑量越高，對勃起功能及生化指標的改善程度越明顯，雖未對血糖有明顯影響，但它可明顯減輕氧化應激損傷，保護陰莖血管內皮細胞，促進eNOS 產生，增加血管舒張因子NO 的產生，從而改善糖尿病大鼠勃起功能。

沉默信息調節因子2 相關酶1（Sirt1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴性的去乙酰化酶，廣泛存在于機體的各種體細胞及生殖細胞中，具有減緩血管內皮細胞衰老、提高血管內皮細胞功能等作用［14］，可通過調節內皮源型一氧化氮合酶（eNOS）等活性來促進NO 生成，改善內皮依賴的血管舒張活性，并延緩內皮細胞衰老［15-16］，故對以內皮功能障礙為主要病因的疾病，特別是勃起功能障礙，它可能是其潛在的治療靶點之一。 Yu等［17］發現，白黎蘆醇可通過激活Sirt1 基因來改善糖尿病大鼠的勃起功能，其主要機制是上調其下游基因eNOS 表達，使內皮細胞能產生更多NO，舒張陰莖動脈，從而增加血流量；本實驗發現，人參皂苷Rg1 也可上調勃起功能障礙大鼠陰莖組織中該因子表達，從而激活其下游基因eNOS 表達。同時，西地那非雖然能提高eNOS、NO 水平，但對SIRT1、SOD 水平的提高程度，以及陰莖組織氧化應激損傷的保護作用不明顯，表明它主要通過抑制PDE-5 來增加eNOS、NO 生成。另外，勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體部分肌纖維結構紊亂甚至纖維化，可能也是影響勃起功能的重要因素，這也是今后研究的重點，也需延長給藥時間來觀察人參皂苷Rg1對陰莖組織的影響，并考察其安全性。

綜上所述，人參皂苷Rg1 能有效減輕勃起功能障礙糖尿病大鼠陰莖組織的氧化應激損傷，明顯改善勃起功能，其主要作用機制可能是上調Sirt1／eNOS 信號通路，從而保護血管內皮細胞功能。