翻白草水提液對大鼠胰島細胞脂毒性損傷的保護作用

孫 潔， 馬 旗， 王 璐， 胡雪劍， 楊 揚， 李 赟， 楊 燕

（蘭州大學第二醫院內分泌代謝科，甘肅 蘭州730030）

以高血糖為標志的糖尿病是重要慢性病之一，迄今高血糖發生機制基本環節中胰島β 細胞衰竭仍是主要因素，而β 細胞凋亡在其功能衰竭的發生中起著決定性作用［1-2］。研究表明，β 細胞長期暴露在高游離脂肪酸環境中可激活其線粒體氧化應激途徑，誘導細胞脂性凋亡，胰島素合成和分泌減少，從而導致β 細胞功能衰退［3-4］。

翻白草為薔薇科委陵菜屬植物翻白草Potentilla discolor Bge.的帶根全草，具有降糖、降脂等多種生物活性，但其具體作用機制尚不明確，目前鮮有關注它對胰島細胞功能的直接影響。黃酮、萜類作為翻白草的主要活性成分，具有抗氧化應激作用［5］，由此假設翻白草可通過抗氧化作用減輕胰島細胞脂性凋亡，從而改善胰島素分泌功能。本實驗采用體外培養的Wistar 大鼠原代胰島細胞，棕櫚酸處理以建立脂毒性損傷細胞凋亡模型，并用翻白草水提液作為干預因素，旨在探討該藥材對胰島細胞脂毒性損傷的影響。

1 材料

1.1 動物 2 月齡健康雄性清潔級Wistar 大鼠30只，購自蘭州大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（甘）2017-0003。

1.2 試劑 翻白草采于甘肅省定西市，經甘肅中醫藥大學藥學院專家鑒定為正品。AnnexinV-FITC試劑盒，購自南京凱基公司；膠原酶P，購自瑞士Roche 公司；大鼠胰島素ELISA 試劑盒，購自美國R＆D 公司；Ficoll 400，購自美國Pharmacia 公司；棕櫚酸、牛血清白蛋白（BSA），購自美國Sigma公司；BML-275（AMPK 選擇性抑制劑），購自美國Santa Cruz 公司；兔抗AMPK（Thr-172） 抗體、鼠抗胰島素抗體，購自美國CST 公司；qPCR 試劑盒，購自日本TaKaRa 公司； 還原型谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA） 試劑盒，購自南京建成生物研究所。

1.3 儀器 FACSCalibur 流式細胞儀（美國BD 公司）；全自動激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司）；凝膠成像系統、實時定量PCR 系統（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 翻白草水提液制備［5］將全草烘干粉碎，加水煎煮3 次，加水量分別為生藥體積的10、10、8倍量，煎煮時間分別為1.5 h、1.5 h、40 min，過濾，合并濾液，蒸發濃縮，70 ℃真空干燥，粉碎，過80 目篩，l g 提取物相當于生藥6 g。稱定提取物62.5 mg，溶于5 mL DMSO 中，配制成12.5 g／L的母液，實驗時吸取16 μL 母液加到2 mL 培養基中，配成10 mg／L 含藥培養基。

2.2 胰島分離和純化 大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，消毒后從下腹作V 型切口，膽總管插管，破心放血后，經膽總管逆行注入膠原酶P 溶液，摘除完整胰腺，37 ℃水浴消化11 min，Hank’s液終止消化，沉淀物加4 mL25%Ficoll 混勻，再加入23%、 20%、 11% Ficoll 液 和Hank’ s 液 各2 mL，1 900 r／min 離心25 min，收集23%→20%、20%→11%界面上細胞層，純化的胰島懸液接種于RPMI 1640 培養液， 細胞鋪展貼壁后進行分組培養。

2.3 胰島染色 將胰島制備物與雙硫腙混合后孵育10 min，倒置顯微鏡下計數雙硫腙細胞團數（胰島細胞為猩紅色，非胰島細胞不著色）。

2.4 分組 ①對照組， 培養在0.5% BSA 中；②棕櫚酸組，劑量0.5 mmol／L；③翻白草水提液+棕櫚酸組，劑量分別為10 mg／L、0.5 mmol／L，共同孵育；④BML-275 組，含0.5 mmol／L 棕櫚酸+10 mg／L 翻 白 草 水 提 液+10 μmol／L BML-275，BML-275 預處理胰島細胞1 h 后再與翻白草水提液、棕櫚酸共同孵育。胰島細胞均孵育24 h。

2.5 FDA／PI 熒光雙染 雙醋酸熒光素（FDA）可侵入活細胞發出綠色熒光，而活細胞對PI 染料拒染，PI 與死亡細胞的核酸結合，發出紅色熒光。吸盡6 孔板中舊培養基，取適量FDA／PI 熒光染液，與胰島制備物混合5 ～10 min，在共聚焦顯微鏡下檢測。

2.6 細胞凋亡率檢測 胰島以0.05%胰酶-EDTA消化分散成單細胞懸液后，接種于6 孔板，待細胞貼壁生長穩定后按“2.4” 項下不同干預措施孵育24 h。 收集細胞，多次離心、 洗滌后依次加入10 μL FITC 標記的AnnexinV， 輕輕混勻， 避光15 min后再加入300 μL Binding Buffer 和5 μL 碘化丙啶（PI），避光反應5 min 后上機檢測。

2.7 胰島素分泌功能檢測 計數大鼠胰島，換算為相當于直徑150 μm 的胰島當量 （IEQ）， 于15 cm培養皿中接種30 IEQ／皿。干預24 h 后，每組收集15 個胰島，PBS 洗滌，加入含3.0 mmol／L葡萄糖KRBH 培養液緩沖30 min 后，分別在含3.0 mmol／L（低糖）、20 mmol／L（高糖） 葡萄糖的KRBH 培養液中培養1 h，上清液與-20 ℃冰箱中保存，ELISA 檢測基礎胰島素分泌（BIS）、葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS），計算刺激指數（SI），公式為SI=BIS／GSIS。

2.8 免疫熒光檢測 胰島細胞接種于載玻片上，相應干預后4%多聚甲醛固定， 封閉后， 兔抗AMPK（腺苷酸激活的蛋白激酶） 抗體和鼠抗胰島素抗體過夜孵育，DAPI 染色，封片，激光共聚焦下觀察。

2.9 實時熒光定量PCR（qPCR） 檢測 Trizol 裂解后抽提細胞總RNA，逆轉錄生成cDNA，qPCR 檢測目的基因mRNA 表達水平，以β-actin 為內參，2-ΔΔCt計算其相對表達量。引物序列如表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.10 蛋白免疫印跡檢測 抽提總蛋白，測定蛋白量后常規SDS-PAGE 電泳轉膜，5%脫脂奶粉封閉，依次加入稀釋的相應一抗、二抗反應，并依次洗脫，ECL 顯影曝光，Quantity One 軟件進行圖像灰度值分析，以條帶灰度值之比計算目的蛋白相對表達量。

2.11 氧化應激指標檢測 收集各處理組胰島細胞，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛（MDA） 活性，分光光度計法檢測還原型谷胱甘肽（GSH） 活性，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

2.12 統計分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，數據用（） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩樣本均數比較采用t 檢驗。以P＜0.05 為差異有顯著性意義。

3 結果

3.1 胰島分離及胰島β 細胞原代培養 純化的大鼠胰島細胞培養在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中18 ～24 h，可見貼壁生長。圖1 顯示，DTZ 染色后大鼠胰島呈現細胞團樣結構，猩紅色，圓形或橢圓形，包膜不明顯，折光性較強，直徑50 ～300 μm 不等，而其他外分泌細胞、成纖維細胞未見紅染。本實驗分離大鼠胰島細胞純度為（89.23±2.9）%，每只可分離（823±24） 個胰島，細胞存活率在（93.1±3.1）%以上。

圖1 大鼠胰島DTZ 染色Fig.1 DTZ staining of rat islets

3.2 翻白草水提液對棕櫚酸誘導胰島細胞凋亡的抑制作用 FDA／PI 雙染后共聚焦顯微鏡（圖2）顯示，對照組很少見到死亡細胞；棕櫚酸組紅色熒光的死亡細胞，明顯多于對照組；翻白草水提液干預后死亡細胞明顯少于棕櫚酸組，細胞存活率明顯更高。AnnexinV／PI 雙染流式細胞術（圖3） 顯示，對照組細胞凋亡率為（11.35±0.80）%；棕櫚酸持續作用于胰島細胞24 h 后， 凋亡率顯著升高［ （36.35±1.55）%，P＜0.01］；翻白草水提物+棕櫚酸組細胞凋亡率顯著降低［ （20.47±0.84）%，P＜0.01］。

圖2 大鼠胰島細胞FDA／PI 雙染Fig.2 FDA／PI double staining of rat islet cells

圖3 翻白草水提液對大鼠胰島細胞脂毒性凋亡的影響Fig.3 Effect of aqueous extract of Potentillae discoloris Herba on lipotoxicitic apoptosis of rat islet cells

3.3 翻白草水提液對GSIS 的影響 低糖、高糖溶液中胰島素分泌量分別為（5.97±0.31）、（21.03±1.11） μIU／mL，SI 為3.52，表明正常情況下胰島β 細胞分泌功能良好。圖4 顯示，與對照組比較，棕櫚酸組胰島細胞GSIS 顯著減少 ［棕櫚酸組（11.62±0.58） μIU／mL，對照組（21.03±1.11）μIU／mL，P＜0.01］；與棕櫚酸組比較，翻白草水提物+棕櫚酸組GSIS 顯著增加［翻白草水提物+棕櫚 酸 組 （17.28±0.86） μIU／mL， 棕 櫚 酸 組（11.62±0.58） μIU／mL，P＜0.01］。

圖4 翻白草水提液對GSIS 的影響Fig.4 Effect of aqueous extract of Potentillae discoloris Herba on GSIS

3.4 翻白草水提液對FAS、CPT-1、AMPK 表達的影響 表2、圖5A 顯示，與對照組比較，棕櫚酸組FAS mRNA 表達顯著升高， CPT-1 mRNA、 p-AMPK 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與棕櫚酸組比較，翻白草水提物+棕櫚酸組中FAS mRNA 表達顯著下降，CPT-1 mRNA 表達、p-AMPK 表達顯著升高（P ＜0.05）。圖5B 顯示，棕櫚酸處理后p-AMPK 免疫熒光強度較對照組明顯減弱；與棕櫚酸組比較，翻白草水提物+棕櫚酸組其熒光染色明顯增強。

表2 翻白草水提液對FAS、CPT-1 mRNA 表達的影響（，n=30）Tab.2 Effects of aqueous extract of Potentillae discoloris Herba on FAS and CPT-1 mRNA expressions（±s，n=30）

表2 翻白草水提液對FAS、CPT-1 mRNA 表達的影響（，n=30）Tab.2 Effects of aqueous extract of Potentillae discoloris Herba on FAS and CPT-1 mRNA expressions（±s，n=30）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與棕櫚酸組比較，#P＜0.05

組別 FAS CPT-1對 棕照 櫚組 酸 組 12..05 01± ±00..00 05 ? 10..05 00± ±00..00 0 5?翻白草水提物+棕櫚酸組 1.72±0.35# 0.80±0.08#

3.5 翻白草水提液對GSH、MDA 水平的影響 表3 顯示，與對照組比較，棕櫚酸組GSH 水平顯著降低，MDA 水平顯著升高（P＜0.05）；與棕櫚酸組比較，翻白草水提物+棕櫚酸組前者水平顯著升高，后者水平顯著降低（P＜0.05）。

圖5 翻白草水提液對p-AMPK 蛋白表達的影響Fig.5 Effect of aqueous extract of Potentillae discoloris Herba on p-AMPK protein expression

表3 翻白草水提液對GSH、MDA 水平的影響（±s，n=30）Tab.3 Effects of aqueous extract of Potentillae discoloris Herba on GSH and MDA levels（±s，n=30）

表3 翻白草水提液對GSH、MDA 水平的影響（±s，n=30）Tab.3 Effects of aqueous extract of Potentillae discoloris Herba on GSH and MDA levels（±s，n=30）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與棕櫚酸組比較，#P＜0.05

GSH／MDA／組別 （μmol·L-1） （nmol·mg prot-1）對棕翻照櫚白組酸草 組水 提 物+棕櫚酸組211 057 819...508±±±111 001...630 393 ?# 021...723 507±±±000...121 322?#

3.6 BML-275 對FAS、 CPT-1、 AMPK 表 達 及GSH、MDA 水平的影響 BML-275 預處理胰島細胞1 h 后，再加入翻白草水提液和棕櫚酸共同孵育24 h，結果見表4、圖6。由此可知，與翻白草水提物+棕櫚酸組比較，BML-275 組CPT-1 mRNA表達、p-AMPK 蛋白表達、 GSH 水平顯著降低，FAS mRNA 表 達、 MDA 水 平 顯 著 升 高 （P ＜0.05）。

注：與對照組比較，?P＜0.05；與棕櫚酸組比較，#P＜0.05；與翻白草水提物+棕櫚酸組比較，＆P＜0.05

圖6 BML-275 對p-AMPK 蛋白表達的影響Fig.6 Effect of BML-275 on p-AMPK protein expression

4 討論

游離脂肪酸長期升高可使胰島β 細胞凋亡、數量減少、功能衰竭，稱為“脂性凋亡”。本實驗采用胰島原代細胞培養、FDA／PI 雙染、AnnexinV／PI 雙染流式定量方法，觀察棕櫚酸對胰島細胞凋亡的影響，發現該成分可誘導胰島細胞凋亡，降低細胞存活率，然后檢測大鼠胰島細胞BIS／GSIS 水平，發現它對胰島細胞BIS 水平無顯著影響，但能抑制GSIS 水平，表明它損傷了β 細胞分泌功能。GSIS 損害是2 型糖尿病早期特征之一，由于脂肪酸誘導β 細胞死亡、數量減少及其導致的胰島素分泌功能受損，至少有一部分歸因于脂毒性凋亡，故推測防止β 細胞脂性凋亡可能有益于預防或治療T2DM。

萜類、黃酮是翻白草主要化學成分，其中后者能有效地調節糖脂代謝［6-9］，但其具體降糖機制尚未闡明。韓永明等［10］報道，翻白草能有效保護胰島β 細胞；鄒志堅等［11］通過大鼠腹腔注射四氧嘧啶建立糖尿病模型，分為高、中、低3 個劑量組，連續給予黃酮提取物14 d 后發現，胸腺指數、超氧化物歧化酶活性明顯上升，血清丙二醛水平明顯下降，表明該成分對糖尿病大鼠有治療作用，可能是通過提高抗氧化能力和增強免疫力來實現的；本實驗發現，翻白草水提液處理后胰島細胞凋亡率較棕櫚酸明顯下降，而細胞存活率、GSIS 明顯升高，表明它可抑制胰島細胞脂性凋亡，改善β 細胞已受損的分泌功能。胰島細胞中抗氧化酶水平很低，易受氧化應激損傷，而長期暴露在高游離脂肪酸環境下可使線粒體活性氧簇生成增加，氧化應激激活，線粒體功能發生障礙，誘導細胞凋亡，從而損害β 細胞的合成與分泌功能，故氧化應激毒性是導致胰島細胞脂性凋亡的直接原因［12］。本實驗發現，棕櫚酸處理后胰島細胞內脂質過氧化產物MDA 水平明顯升高，非酶性抗氧化物GSH 水平明顯降低，提示游離脂肪酸的負載引起胰島細胞氧化與抗氧化系統失衡，導致胰島細胞氧化應激；翻白草水提液干預后可降低胰島細胞MDA 水平，升高GSH 水平，表明它可緩解游離脂肪酸誘導的胰島細胞氧化應激反應。

AMPK 是細胞內的能量和代謝感受器，由α、β、γ 三個亞單位構成的三聚體，前者α 亞基是AMPK 的主要催化亞基，當其（Thr172 位點） 磷酸化后可激活AMPK，從而參與調節細胞內糖、脂肪酸和能量代謝［13］，而AMPK 對脂質代謝的影響是通過抑制乙酰輔酶A 羧化酶、FAS 等脂肪酶的活性抑制脂肪合成，同時增加CPT-1 活性以促進脂肪酸氧化［14］。本實驗發現，棕櫚酸可明顯抑制胰島細胞中p-AMPK 蛋白表達，增加其下游靶基因FAS mRNA 表達，減少CPT-1 mRNA 表達，表明它能抑制AMPK 通路激活；翻白草水提液處理后，能緩解棕櫚酸對AMPK 通路的抑制作用，上調p-AMPK 蛋白表達及其靶基因CPT-1 mRNA 表達，并下調了FAS mRNA 表達，但AMPK 特異性抑制劑BML-275 則衰減了這一作用，表明翻白草水提液減輕脂毒性的作用至少有一部分依賴于其對AMPK通路的調節。

研究表明，AMPK 激活后可抑制NADPH 氧化酶的胞質內亞基p47phox、p67phox表達，從而緩解高糖誘導的血管內皮細胞的氧化應激［15］，它可通過激活核因子E2 相關因子2（Nrf2）介導的抗氧化信號通路，上調肝細胞抗氧化酶（如超氧化物岐化酶，過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶） 表達，從而減輕氧化應激反應［16］；同時還能增加NADPH數量，減少NADPH 消耗，減輕成骨細胞氧化應激反應， 從而調節骨代謝平衡［17］。 本實驗發現，BML-275 組胰島細胞中MDA 水平較翻白草水提物+棕櫚酸組明顯升高、GSH 水平明顯降低，表明AMPK 活性的抑制減緩了翻白草水提物對棕櫚酸誘導胰島細胞氧化應激反應的緩解作用。

綜上所述，在脂肪酸誘導的胰島細胞脂性損傷模型中，翻白草水提液可能通過激活AMPK 通路，抑制脂肪酸合成，促進脂肪酸β 氧化，減輕脂毒性，緩解細胞氧化應激反應，從而減輕細胞脂性凋亡，最終改善胰島細胞結構和功能的損傷，這將為該藥材及其有效成分治療2 型糖尿病提供新的理論依據。今后，將進一步觀察和探索翻白草在體內的功能和調節機制，以期更有力地證實本實驗結果。