八味龍鉆顆粒HPLC 指紋圖譜建立及7 種成分測定

陸敏靈， 覃潔萍?， 羅宇東， 譚紅聲， 梁梓敏， 郭海姣

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠，廣西 南寧530023）

類風濕關(guān)節(jié)炎是一種嚴重危害人類健康的常見病、多發(fā)病，目前國內(nèi)外尚無特效藥物。八味龍鉆顆粒是廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥專家龐宇舟教授在挖掘總結(jié)壯醫(yī)藥治療類風濕關(guān)節(jié)炎傳統(tǒng)藥物的基礎(chǔ)上結(jié)合“壯醫(yī)毒論” 內(nèi)涵［1］，按照壯醫(yī)理論配伍臨床驗方研發(fā)的壯成藥，主要由飛龍掌血、大鉆、兩面針、青風藤、雞血藤、九龍?zhí)佟私菞鳌⑽逯该? 味藥材組成，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗風濕、免疫抑制之功效，治療類風濕關(guān)節(jié)炎療效顯著，方中九龍?zhí)佟㈦u血藤等常用于治療風濕性免疫病［2］，其中前者具有較強的鎮(zhèn)痛抗炎活性，是壯醫(yī)風濕免疫病專科常用藥［3］，而后者具有活血補血、通絡(luò)、祛風除濕功效；青風藤祛風散瘀，利濕止痛；五指毛桃健脾益氣，化濕舒筋，行氣止痛［4］；飛龍掌血生物總堿、乙醇提取物、水提物均有鎮(zhèn)痛抗炎作用［5-6］，在民間主要用于治療風濕疼痛、胃痛、跌打損傷、吐血、刀傷出血、經(jīng)閉、痛經(jīng)等癥［7］；兩面針具有消腫止痛作用［8-10］；大鉆（大血藤） 中紅景天苷有抗疲勞、抗炎、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，是其活性成分之一［11］；青藤堿具有抗炎［12］、鎮(zhèn)痛、抗風濕［13］等藥理作用；補骨脂素常被用作五指毛桃質(zhì)量控制指標［14-16］；橙皮苷具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等藥理活性［17］；氯化兩面針堿在抗炎方面作用顯著［18］；沒食子酸、原兒茶酸均具有明顯抗氧化、抑制血小板聚集作用［19］；兒茶素具有一定促進造血細胞增殖作用，是雞血藤補血活血的主要物質(zhì)基礎(chǔ)［20］；沒食子酸具有抗菌、抗氧化及抗腫瘤的藥理作用［21-22］。

本實驗在課題組前期測定氯化兩面針堿、橙皮苷、補骨脂素含有量的基礎(chǔ)上，建立該制劑HPLC指紋圖譜，并測定沒食子酸、原兒茶酸、青藤堿、紅景天苷、兒茶素、橙皮苷、補骨脂素的含有量，以期更全面系統(tǒng)地評價其質(zhì)量，確保臨床應(yīng)用安全有效。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置紫外檢測器；KQ5200 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16G 離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SQP 電子天平［十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］。

沒食子酸（110831-201605，含有量90.8%）、原兒茶酸（110809-201205，含有量99.9%）、青藤堿（110774-200507， 含有量99.1%）、 紅景天苷（110818-2015007， 含 有 量 99.4%）、 兒 茶 素（110877-201604， 含 有 量 99.2%）、 橙 皮 苷（110721-201617， 含 有 量 96.7%）、 補 骨 脂 素（110739-201617，含有量99.1%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純 （美國Fisher 公司）；甲醇、磷酸為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）； 超純水由密思博超純水機制備。

10 批八味龍鉆顆粒（10 g／袋，每袋相當于原藥材35 g，批號20170501、20170502、20170503、20170701、 20170702、 20170703、 20170704、20170705、20170706、20170707），均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠提供。八角楓、大鉆、飛龍掌血、雞血藤、兩面針、九龍?zhí)佟⑽逯该摇⑶囡L藤均購自廣西玉林市祥生中藥飲片有限責任公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠質(zhì)量保證部羅宇東副主任藥師鑒定為正品，均符合 《廣西瑤藥材質(zhì)量標準》 相關(guān)要求。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex Gemini C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈 （A） -0.1%磷酸 （B）， 梯度洗脫 （0 ～10 min，6%A；10～20 min， 12%A； 20 ～30 min， 19%A； 30 ～40 min，27%A；40 ～50 min，35%A；50 ～60 min，45%A）；檢測波長270 nm（0 ～50 min）、245 nm（50 ～60 min）；柱溫30 ℃；體積流量1 mL／min；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取沒食子酸、原兒茶酸、青藤堿、紅景天苷、兒茶素、橙皮苷、補骨脂素對照品適量，甲醇分別制成1.357 8、0.960 0、0.740 0、0.901 0、1.014 2、0.126 0、0.945 0 mg／mL貯備液，取適量置于同一量瓶中，甲醇分別制成0.069 6、0.008 7、0.204 6、0.256 4、0.100 4、0.024 3、0.007 1 mg／mL 溶液，即得，置于冰箱中貯存。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取顆粒3 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，稱定質(zhì)量，超聲 （200 W、40 kHz） 20 min， 冷卻至室溫，70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，續(xù)濾液離心，取上清液，即得。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 穩(wěn)定性試驗 取顆粒（批號20170501） 適量，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，以6 號峰（青藤堿） 保留時間和色譜峰峰面積為參照，測得其余11 個共有峰相對保留時間RSD 為0.33%～1.8%，相對峰面積RSD 為0.88%～1.7%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.2 精密度試驗 取顆粒（批號20170501） 適量，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，以6 號峰（青藤堿） 保留時間和色譜峰峰面積為參照，測得其余11 個共有峰相對保留時間RSD 為0.40%～1.6%，相對峰面積RSD 為0.62%～1.8%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批顆粒（批號20170501）6 份，每份約3 g，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，以6 號峰（青藤堿） 保留時間和色譜峰峰面積為參照，測得其余11 個共有峰相對保留時間RSD 為0.18%～1.2%，相對峰面積RSD 為0.33%～1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 建立方法 取10 批顆粒，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，見圖1，再建立HPLC 指紋圖譜的共有模式圖譜（平均值），通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)” 進行分析，見圖2。在對照圖譜上共生成12 個共有峰，其中對照圖譜中6 號色譜峰（青藤堿） 分離度較好，色譜響應(yīng)值較高，保留時間居中，故選擇其作為參照峰。指紋圖譜相似度評價采用 “中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723 版） ”，結(jié)果見表1，可知相似度均在0.989 以上，指標性成分一致性較好。

表1 10 批樣品相似度Tab.1 Similarities of ten batches of samples

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

圖2 各成分HPLC 色譜圖（Ⅰ）Fig.2 HPLC chromatogram of various constituents（Ⅰ）

2.3.5 主要共有峰歸屬分析 精密吸取各對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，同時記錄色譜圖和各色譜峰紫外吸收光譜，并與指紋圖譜共有模式中的各主要共有峰進行對比。結(jié)果，3、5、6、7、9、10、12 號峰分別為沒食子酸、原兒茶酸、青藤堿、紅景天苷、兒茶素、橙皮苷、補骨脂素。

2.4 7 種成分含有量測定

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗 取對照品、供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖3。由圖可知，各成分色譜峰分離度良好，拖尾因子均在0.95～1.05 之間，其他成分無干擾，理論塔板數(shù)以青藤堿計為33 000。

圖3 各成分HPLC 色譜圖（Ⅱ）Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents（Ⅱ）

2.4.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.1” 項下對照品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣4、6、8、10、12、14 μL 測定。以峰面積為縱坐標（Y），進樣量為橫坐標（X） 進行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度試驗 取“2.2.1” 項下對照品溶液，在“2.1” 色譜條件下進樣測定6 次，測得沒食子酸、原兒茶酸、青藤堿、紅景天苷、兒茶素、橙皮苷、 補骨脂素峰面積RSD 分別為1.3%、1.3%、 0.77%、 0.87%、 1.1%、 0.94%、 1.2%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取顆粒（批號20170501） 適量，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、原兒茶酸、青藤堿、紅景天苷、兒茶素、橙皮苷、補骨脂素峰面積RSD 分別為1.2%、 1.1%、 1.4%、 1.8%、 1.0%、 1.0%、1.2%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 精密稱取顆粒 （批號20170501）6 份，每份3.0 g，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、原兒茶酸、青藤堿、紅景天苷、兒茶素、橙皮苷、補骨脂素峰含有量RSD 分別為0.76%、1.9%、2.0%、1.5%、2.0%、1.5%、1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取顆粒（批號20170501） 約1.5 g（沒食子酸、原兒茶酸、青藤堿、紅景天苷、兒茶素、橙皮苷、補骨脂素含有量分別 為0.695 9、 0.136 4、 3.562 0、 3.699 1、1.213 6、0.323 4、0.076 5 mg／g），共6 份，分別精密加入沒食子酸、原兒茶酸、青藤堿、紅景天苷、兒茶素、橙皮苷及補骨脂素對照品1.050 0、0.205 0、5.500 0、5.600 0、1.820 0、0.480 0、0.120 0 mg，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，各成分平均加樣回收率分別為103.6%、102.1%、102.5%、99.6%、103.2%、99.2%、98.5%，RSD 分 別 為1.1%、 1.0%、 1.4%、 1.7%、 1.4%、0.92%、1.3%。

2.4.7 樣品含有量測定 精密稱取10 批顆粒各2份，每份約3 g，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g，n=2）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g，n=2）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 本實驗以甲醇、乙醇、水、1%鹽酸、85%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇為提取溶劑，比較了超聲、回流提取，以及提取時間、溶劑用量、提取次數(shù)等因素對各成分含有量的影響。結(jié)果，3 g 樣品加50 mL 70%甲醇超聲20 min 時，沒食子酸、原兒茶酸、青藤堿、紅景天苷、兒茶素、橙皮苷、補骨脂素含有量最高，而且操作簡便，故選擇其作為供試品溶液制備方法。

3.2 檢測波長選擇 本實驗采用二極管陣列檢測器進行檢測，比較各成分在不同波長下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)各成分最大吸收波長有明顯差異，雖然大多在270 nm 處均有較高的靈敏度和較好的峰形，但補骨脂素峰形不理想，故選擇多波長檢測。最終確定，沒食子酸、原兒茶酸、青藤堿、紅景天苷、兒茶素、橙皮苷在270 nm 波長處檢測，而補骨脂素在其最大吸收波長245 nm 處檢測，此時各成分響應(yīng)值高，色譜峰峰形和分離度良好。

3.3 專屬性分析 八味龍鉆顆粒HPLC 指紋圖譜中標定了12 個共有峰，并指認出其中7 個。雖然10 批樣品是由不同產(chǎn)地、批次藥材制得，各成分含有量可能存在一定差異，但其相似度較好，均在0.989 以上，表明指紋圖譜相對穩(wěn)定，不同批次樣品中指標性成分的一致性較好。

4 結(jié)論

本實驗建立八味龍鉆顆粒HPLC 指紋圖譜，并測定其中沒食子酸、原兒茶酸、青藤堿、紅景天苷、兒茶素、橙皮苷、補骨脂素的含有量，可同時用于該制劑主要成分的定性、定量分析，而且該方法簡便快速，準確可靠，穩(wěn)定性好，可為其質(zhì)量控制與評價提供更有效的檢測手段。