回乳抑增顆粒回流提取工藝的優(yōu)化

鄒吉利， 盛 碧， 陳永剛， 李 穎

（武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢430061）

高泌乳素血癥為女性內(nèi)分泌系統(tǒng)常見疾病，由下丘腦-垂體-性腺軸系統(tǒng)病變引起內(nèi)分泌紊亂、激素失調(diào)所致［1］。近年來研究顯示，泌乳素含有量與肝郁有關(guān)，肝氣郁結(jié)、情志不遂可使氣血逆亂、臟腑功能失調(diào)，從而導(dǎo)致泌乳素異常升高［2-3］，中醫(yī)主要采用疏肝理氣、調(diào)攝沖任、逐瘀化痰方法進行治療［4］。復(fù)方回乳抑增一號是武漢市第三醫(yī)院用于治療高泌乳素血癥的臨床經(jīng)驗方［5］，由于原方回乳抑增方藥量過大，前期已對其進行優(yōu)化［6］，優(yōu)化后的處方組成為生麥芽、夏枯草、郁金、丹參、玄參、浙貝母、白芥子、牡蠣、淡昆布、山慈菇7 味藥材，但作為傳統(tǒng)湯劑在臨床使用時仍有很多不便之處［7］，如不宜攜帶、服用麻煩、難以保存、質(zhì)量不可控制等，故需要對該劑型進行改進，制成顆粒劑。本實驗將在單因素試驗基礎(chǔ)上通過正交試驗優(yōu)化回乳抑增顆粒回流提取工藝，并結(jié)合藥效學(xué)實驗加以驗證，為后期相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（UltiMate 3000，美國Dionex 公司）；PH 計（pHS-3C，上海今邁儀器儀表有限公司）；萬分之一電子天平（BS110S，德國Sartorius 公司）；超聲波清洗器（KQ-300E，昆山市超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-2，江蘇省金壇市融化儀器制造有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-3000，上海亞榮生化儀器廠）；醫(yī)用低速離心機（BY-320C，北京白洋醫(yī)用離心機有限公司）；實驗室超純水機（Master-SUF，上海和泰儀器有限公司）。

1.2 試藥 生麥芽、夏枯草、玄參、山慈菇、浙貝母、昆布、牡蠣購于亳州市豪門中藥飲片有限公司，經(jīng)武漢市第三醫(yī)院藥學(xué)部吳金虎主任藥師鑒定為正品，符合2015 年版《中國藥典》 一部相關(guān)項下規(guī)定。甲磺酸溴隱亭片（T3A285A，匈牙利吉瑞大藥廠）；鹽酸甲氧氯普胺注射液（1404531-B31，國藥集團容生制藥有限公司）。迷迭香酸（MUST-13110115，含 有 量 98%）、 哈 巴 俄 苷 （MUST-13071801，含有量98%） 對照品（成都曼思特生物科技有限公司）。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水。

1.3 動物 雌性未孕Wistar 大鼠，體質(zhì)量180 ～200 g，由武漢市疾病防控中心實驗動物中心提供，合格證號42000600004378。

2 方法與結(jié)果

2.1 迷迭香酸、哈巴俄苷含有量測定

2.1.1 色譜條件 Wondasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈 （A） -0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～10 min，95%B；10 ～30 min，95%～70%B；30 ～55 min，70%～80%B）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長270 nm；進樣量20 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品迷迭香酸13.2 mg、哈巴俄苷8.86 mg，置于同一50 mL量瓶中， 50%甲醇溶解并稀釋至刻度， 搖勻，0.2 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 稱取藥材處方量（夏枯草、生麥芽、浙貝母、玄參、山慈菇、昆布、牡蠣共173 g） 的1／2，加入50%乙醇692 mL（8 倍體積），于70 ℃下加熱，回流提取1 h，過濾，濾液蒸干，置于100 mL 量瓶中，50%乙醇稀釋至刻度，混勻，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mL， 置于25 mL 量瓶中，50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y） 進行回歸，得方程分別為迷迭香酸Y=0.697 2X-0.372 1（R2=0.999 8）、哈巴俄苷Y=0.86X-0.739（R2=0.999 4），分別在2.59 ～206.98、1.74～138.92 mg／L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.2” 項下對照品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6次，測得迷迭香酸、哈巴俄苷峰面積RSD 分別為0.36%、1.12%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.1.3” 項下供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下于1、2、4、6、12、24 h 進樣測定，測得迷迭香酸、哈巴俄苷峰面積RSD 分別為0.22%、0.49%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 按處方比例稱取藥材6 份，按“2.1.3” 項下方法平行制備供試品溶液，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得迷迭香酸、哈巴俄苷峰面積RSD 分別為1.17%，2.27%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密量取各成分含有量已知的供試品6 份，每份5 mL，置于10 mL 量瓶中，分為2 組，加入“2.1.2” 項下對照品溶液1、1.2、1.4 mL，平行3 份，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，迷迭香酸、哈巴俄苷平均加樣回收率分別為99.67%、100.83%，RSD 分別為1.09%、0.82%。

2.2 浸膏得率測定 精密移取提取液50 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105 ℃常壓干燥至恒重，取出，置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計算浸膏得率。

2.3 單因素試驗

2.3.1 溫度 稱取4 份處方量藥材（173 g） 的1／2，加入50%乙醇692 mL（8 倍體積），50、60、70、80 ℃水浴回流提取60 min，濾液濃縮，真空干燥箱中干燥成浸膏后，置于100 mL 量瓶中，50%乙醇稀釋至刻度，取50 mL 測定浸膏得率，剩余下測定迷迭香酸、哈巴俄苷含有量，計算綜合評分［滿分100 分，根據(jù)夏枯草和玄參在處方中的君臣地位，以及迷迭香酸、哈巴俄苷含有量高低，設(shè)定兩者權(quán)重系數(shù)分別為50、30；由于浸膏得率能反映全方質(zhì)量，故設(shè)定其權(quán)重系數(shù)為20。公式為綜合評分= （迷迭香酸含有量／最大值） ×50+（哈巴俄苷含有量／最大值） ×30+（浸膏得率／最大值）×20］，結(jié)果見表1。由表可知，浸膏得率隨著溫度升高而增加，但在70 ℃后迷迭香酸、哈巴俄苷含有量略有下降，故選擇70 ℃進行后續(xù)實驗。

表1 溫度對提取工藝的影響Tab.1 Effect of temperature on extraction process

2.3.2 乙醇體積分數(shù) 稱取一半處方量藥材6 份，用 水， 20%、 40%、 60%、 80% 乙 醇， 乙 醇 各692 mL回流提取1 h，過濾后，濾液于70 ℃下濃縮回收溶劑，真空干燥（-0.1 MPa） 成干浸膏，置于100 mL 量瓶中，50%乙醇稀釋至刻度，取50 mL測定浸膏得率，剩余測定迷迭香酸、哈巴俄苷含有量，按“2.3.1” 項下公式計算綜合評分，結(jié)果見表2。由表可知，乙醇體積分數(shù)為40%時迷迭香酸、哈巴俄苷含有量最高，但浸膏得率隨其提高而逐步下降，故選擇40%進行后續(xù)實驗。

表2 乙醇體積分數(shù)對提取工藝的影響Tab.2 Effect of ethanol concentration on extraction process

2.4 正交試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分數(shù)（A）、乙醇用量（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D） 作為影響因素，迷迭香酸、哈巴俄苷含有量及浸膏得率的綜合評分作為評價指標(biāo)，因素水平見表3。再按處方比例稱取藥材約87 g，共9 組，按L9（34） 正交試驗優(yōu)化，每組平行2 次，提取液過濾，合并濾液，減壓回收溶劑至干燥，50%甲醇定容至100 mL，在“2.1.1” 項色譜條件下測定迷迭香酸、哈巴俄苷含有量，按“2.2” 項下方法測定浸膏得率，結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表3 因素水平Tab.3 Factors and levels

表4 試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.4 Design and results of tests

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

由此可知，各因素影響程度依次為D＞A＞B＞C；因素D 有顯著影響（P＜0.05），其他3 個因素?zé)o顯著影響（P ＞0.05）；最優(yōu)工藝為A2B1C3D3，由于因素C 中各水平無顯著差異（P＞0.05），故將其修正為A2B1C1D3，即6 倍量40%乙醇提取3 次，每次0.5 h。

2.5 藥效學(xué)實驗

2.5.1 模型建立 文獻［8］ 報道，高泌乳素血癥模型的建立方法為注射鹽酸甲氧氯普胺注射液，以皮下、肌肉注射為主，給藥10 d，每天1 次，或者給藥5 d，每天2 次。本實驗采用皮下注射給藥以減少肌肉損傷，并為了節(jié)省時間采取給藥5 d，每天2 次（早晚各1 次） 的方案，除正常組外每組大鼠給藥量均為75 mg／kg。

2.5.2 分組與給藥 在前期研究基礎(chǔ)上，按處方比例稱取藥材173 g，加8 倍量水提取2 次，每次30 min，濾過，合并濾液，濃縮至80 mL，作為水提組；取等量藥材，加6 倍量40%乙醇回流提取3次，每次0.5 h，濾過，合并濾液，濃縮至80 mL，作為醇提1 組；取等量藥材，加6 倍量40%乙醇回流提取3 次，每次1.5 h，濾過，合并濾液，濃縮至80 mL，作為醇提2 組。將大鼠隨機分為正常組、模型組、水提組、醇提1 組、醇提2 組、溴隱亭組， 每組8 只， 除正常組外各組大鼠均按“2.6.1” 項下方法建模，然后灌胃給予相應(yīng)藥物，每只2 mL（正常組、模型組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水）。給藥30 d 后，大鼠眼角靜脈取血，測定PRL、P、E2水平。

2.5.3 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 16.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（） 表示，組間比較采用t 檢驗。P＜0.05 表示有顯著性差異。

2.5.4 結(jié)果分析 表6 顯示，模型組泌乳素水平較正常組有顯著變化（P＜0.01），表明造模成功，而且在給予生理鹽水30 d 后未恢復(fù)；醇提1 組、醇提2 組泌乳素水平較模型組有顯著變化（P ＜0.05，P＜0.01），組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P ＞0.05），并均略優(yōu)于水提組。

表6 各組PRL、P、E2 水平的比較（±s，n=8）Tab.6 Comparison of PRL，P and E2levels among various groups（±s，n=8）

表6 各組PRL、P、E2 水平的比較（±s，n=8）Tab.6 Comparison of PRL，P and E2levels among various groups（±s，n=8）

注：與正常組比較，??P ＜0.01；與模型組比較：Δ P ＜0.05，ΔΔ P＜0.01

正模溴水醇醇常型隱提提提組組組亭組12別 組組組 2 P242411 R827677......L931605／317248（±±±±±±n021111 g·.54.31 8..5..L757886-9766 ΔΔ1 ΔΔ?ΔΔΔ） ? ΔΔΔ 33232 337809 P175108......／230666（159441 μ±±±±±±g·113112 6.0217 L.8....-881319 1 57463?） ?ΔΔΔΔΔ ΔΔΔΔΔ E 11 39999 2 658157／......（987686 p521365 m±±±±±±o801211 l·..9.80 L27.7..575738-621 1Δ? Δ?）Δ ΔΔ ΔΔΔ Δ

2.6 驗證試驗 按處方比例稱取同一批藥材3 份，每份87 g，按“2.2” 項下方法制備浸膏（批號141021-1、141021-2、141021-3），按“2.4” 項下優(yōu)化工藝進行3 批驗證試驗，結(jié)果見表7，可知該工藝穩(wěn)定可行。

表7 驗證試驗結(jié)果（n=3）Tab.7 Results of verification tests（n=3）

3 討論

前期預(yù)實驗在水提法、水提醇沉法、醇提法中選擇醇提法，雖然乙醇提取的成本高于水提，但后者過濾十分困難，并且前者可回收再利用。另外，水提醇沉后在治療乳腺增生方面上幾乎沒有發(fā)揮作用。

由于回乳抑增顆粒中的君藥夏枯草為草本植物，而生麥芽中含有大量麥芽糖［9-10］，考慮到中藥“宜粗不宜細” 的原則，故并未進行粉碎過篩，而是直接用原藥材進行提取。本實驗以夏枯草中迷迭香酸［11］、玄參中哈巴俄苷［12］含有量為評價指標(biāo)，這是因為在藥效成分不明的情況下應(yīng)選擇含有量最高者進行考察，同時控制浸膏得率以使浸膏量適當(dāng)，為下一步制劑工藝研究奠定基礎(chǔ)。

在優(yōu)化回乳抑增顆粒回流提取工藝后，本試驗選擇2 個最優(yōu)工藝進行藥效學(xué)試驗，發(fā)現(xiàn)兩者泌乳素水平無明顯差異，并且僅提取時間有區(qū)別。由于該因素影響程度最小，故確定優(yōu)化工藝為6 倍量40%乙醇提取3 次，每次0.5 h。