補骨脂二氫黃酮甲醚在大鼠體內的組織分布

郭曉偉， 錢 珺， 郭夫江， 謝 凡， 李醫明， 王 瑞， 李文艷?

（1.上海中醫藥大學附屬曙光醫院心血管內科，上海200120；2. 上海市浦東新區公利醫院藥劑科，上海200135；3.上海中醫藥大學中藥學院，上海201203）

補骨脂為豆科植物補骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實，其性溫，味辛、苦，歸腎、脾經，具有溫腎助陽、 納氣平喘、 溫脾止瀉的功效［1］，補骨脂二氫黃酮甲醚是從中提取分離得到的天然產物，具有廣泛的生物活性，如抗癌、抗血管生成、抗過敏、抗炎、抗菌、抗氧化、治療阿茲海默癥等［2-8］，課題組前期研究發現［9-10］該成分是天然的過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR） 三重激動劑，有明顯的抗糖尿病、血脂異常特性，而且可改善小鼠脂肪肝；藥代動力學研究顯示，它在大鼠體內的血藥濃度較低，表觀分布容積較大，可能存在廣泛的組織分布［11］，但目前尚無有關其組織分布的報道。因此，本實驗建立超高效液相串聯質譜法（UPLC-MS／MS） 檢測大鼠灌胃給藥后主要器官中補骨脂二氫黃酮甲醚組織濃度，研究該成分組織分布，以期為其體內動態變化過程提供更多數據，合理解釋其有效性和毒副作用，并為后續相關研究提供參考。

1 材料

1.1 試藥 補骨脂二氫黃酮甲醚、補骨脂甲素（內標） 從補骨脂中分離純化得到，其結構通過質譜、氫譜、碳譜鑒定，含有量＞98%。乙腈為色譜純（美國Fisher 公司）； 甲酸為色譜純 （德國CNW 公司）；甲醇等其他試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水（自制）。

1.2 儀器 UltiMate 3000 超高效液相色譜-TSQ 三重四級桿質譜聯用系統，配置脫氣裝置、自動進樣器、柱溫箱、質譜檢測器等（美國Thermo Fisher公司）；BT25S 電子分析天平 （德國Sartorius 公司）；冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；Vortex-5 漩渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；高通量組織研磨儀（上海萬柏生物科技有限公司）。

1.3 動物 清潔級SD 大鼠，雄性，體質量（200±20） g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供［購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號SCXK（滬）2012-0002］，相關動物實驗符合上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會要求（批準文號ACSHU-20110G115）。

2 方法與結果

2.1 標準溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取補骨脂二氫黃酮甲醚約10.0 mg，置于10 mL 量瓶中，乙腈定容，即得，4 ℃下保存。

2.1.2 內標溶液 精密稱取補骨脂甲素約10.0 mg，置于10 mL 量瓶中，乙腈定容，4 ℃下保存。臨用前精密移取適量， 乙腈逐級稀釋成1 μg／mL，即得。

2.2 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相0.05%甲酸-乙腈， 梯度洗脫， 程序見表1； 體積流量0.3 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.3 質譜條件 ESI 離子源， 多反應監測（MRM），正離子模式。噴霧電壓3 500 V；加熱氣溫度300 ℃；鞘氣30 arb（1 arb=175 kPa）；輔助氣10 arb；離子傳輸毛細管溫度251 ℃；掃描峰寬m／z 0.500；單峰掃描時間0.250 s，優化后質譜參數見表2。

表2 優化后各成分質譜參數Tab.2 MS parameters for various constituents after optimization

2.4 組織分布實驗 36 只大鼠隨機分為6 組（5組給藥組，1 組空白組），每組6 只，給藥前禁食12 h，自由飲水。精密稱取補骨脂二氫黃酮甲醚適量，溶于聚乙二醇（PEG400）、聚乙二醇硬脂酸酯（HS15） 中，配制成30 mg／mL 淡黃色透明均一溶液，臨用前生理鹽水稀釋至6 mg／mL，單次灌胃給 藥， 劑 量 為70 mg／kg。 于 給 藥 后0.083、0.25、0.5、1、4 h 麻醉，腹主動脈取血，迅速取出心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、小腸，生理鹽水洗去表面浮血，濾紙吸干殘余液體，分裝，-80 ℃冰箱中凍存備用。

2.5 樣品前處理 分析前，將組織樣品從-80 ℃冰箱中取出，室溫下放置使其自然解凍。精密稱取100 mg，加入3 倍量超純水勻漿（90 s、64 Hz），精密移取50 μL，置于1.5 mL 離心管中，加入補骨脂甲素（內標，1 μg／mL） 5 μL，195 μL 乙腈沉淀蛋白，渦旋5 min，離心（4 ℃、13 000 r／min）10 min，上清液再次離心，置于液相小瓶中分析。2.6 數據處理 Xcalibur 2.2 軟件（美國Thermo公司） 計算每只大鼠給藥后不同時間點各組織中藥物濃度。

2.7 方法學考察

2.7.1 專屬性試驗 取空白肝組織勻漿、加入補骨脂二氫黃酮甲醚（1 ng／mL） 后肝組織勻漿、給藥4 h 后肝組織勻漿適量，按“2.5” 項下方法處理后在“2.2” 和“2.3” 項條件下進樣測定，結果見圖1～2。

圖1 補骨脂二氫黃酮甲醚MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of bavachinin

圖2 補骨脂甲素（內標） MRM 色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of bavachin（internal standard）

由圖可知，樣品預處理后內源性物質不干擾待測物、內標測定，方法專屬性良好。

2.7.2 線性關系考察 精密移取內標溶液（1 μg／mL）5 μL、“2.1.1”項下對照品溶液5 μL、乙腈190 μL，加入50 μL 空白組織勻漿中，按“2.5” 項下方法處理，配制成含補骨脂二氫黃酮甲醚600、500、300、100、50、20、5、2、1、0.4 ng／mL 的標準樣品溶液，在“2.2” 和“2.3” 項條件下進樣測定。以待測物質量濃度為橫坐標（X），待測物與內標峰面積比值為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表3，可知該成分在各組織中線性關系良好，最低定量限（LLOQ） 為0.4 ng／mL（信噪比S／N＞5）。

表3 補骨脂二氫黃酮甲醚在各組織中的線性關系Tab.3 Linear relationships of bavachinin in various tissues

2.7.3 精密度、準確度試驗 取“2.7.2” 項下標準樣品溶液（0.4 ng／mL） 及低、中、高質量濃度 （1、 50、 500 ng／mL） 質 控 樣 品 溶 液， 按“2.5” 項下方法處理， 于24 h 內在 “2.2” 和“2.3” 項條件下進樣測定5 次，連續3 d，結果見表4，可知該方法精密度、準確度良好。

表4 精密度、準確度試驗結果（n=6）Tab.4 Results of accuracy and precision tests（n=6）

2.7.4 提取回收率、基質效應試驗 取“2.7.2”項下標準樣品溶液及“2.7.3” 項下質控樣品溶液，平行6 份，在“2.2” 和“2.3” 項條件下進樣測定，比較提取后的峰面積與空白勻漿提取后加入補骨脂二氫黃酮甲醚的峰面積，考察提取回收率； 比較向提取后空白組織勻漿液中加入“2.1.1” 項下對照品溶液所得峰面積與相同質量濃度對照品溶液所得峰面積，考察基質效應，結果見表5，可知均符合FDA 生物樣品分析指南［12］規定。

表5 提取回收率、基質效應試驗結果（n=6）Tab.5 Results of extraction recovery and matrix effect tests（n=6）

2.7.5 穩定性試驗 空白肝臟勻漿中加入補骨脂二氫黃酮甲醚，制備標準樣品、質控樣品溶液，平行6 份，室溫下放置24 h（短期穩定性），-80 ℃下放置2 周（長期穩定性），反復凍融3 次（凍融穩定性），自動進樣器中放置8 h（自動進樣器穩定性） 后，在“2.2” 和“2.3” 項條件下進樣測定，結果見表6，可知待測物在組織樣品中穩定。

表6 穩定性試驗結果（n=6）Tab.6 Results of stability tests（n=6）

2.8 組織濃度測定 將灌胃后0.083、0.25、0.5、1、4 h 分離的各組織制成勻漿，按“2.5”項下方法處理，測定組織濃度，公式為組織濃度=樣品溶液質量濃度×稀釋倍數 （5 倍） ×0.3 mL／組織質量，結果見表7、圖3。灌胃給藥后各組織中均可檢測到補骨脂二氫黃酮甲醚，其組織濃度依次為胃＞小腸＞肝＞肺＞腎＞脾＞心＞腦，而且除胃、小腸（0.25 h） 外其他組織在0.5 h達到最高濃度。

表7 補骨脂二氫黃酮甲醚組織濃度測定結果（n=6）Tab.7 Results of tissue concentration determination of bavachinin（n=6）

圖3 不同時間點各組織中補骨脂二氫黃酮甲醚組織濃度Fig.3 Tissue concentrations of bavachinin in various tissues at different time points

3 討論

生物樣品通常樣品量少，藥物濃度低，并含有大量內源性雜質。本實驗建立UPLC-MS／MS 法，并選擇MRM 模式，具有較高的精密度與分辨率，并可有效避免其他內源性雜質對待測物的干擾［13］，而且該方法靈敏、穩定、可靠，分析時間短，可用于生物樣品中低濃度補骨脂二氫黃酮甲醚的檢測。

本實驗發現，補骨脂二氫黃酮甲醚在心、肝、脾、肺、腎、腦中的分布較迅速，5 min 后即可檢測到該成分，15 min 后達到較高濃度，達峰時間約為30 min，1 h 后其組織濃度明顯降低，4 h 后基本消除，這與課題組前期藥動學研究結果一致；腦中也有補骨脂二氫黃酮甲醚，表明該成分可通過血腦屏障；肝中補骨脂二氫黃酮甲醚組織濃度較高，表明該成分可能在肝臟富集，從而發揮緩解脂肪肝的作用。胃和小腸是藥物主要吸收器官，由于補骨脂二氫黃酮甲醚呈弱酸性和脂溶性，故在胃酸環境中主要呈非離子型，易在胃腸中被動擴散吸收［14］，本實驗發現給藥1 h 后小腸中該成分組織濃度再次升高，可能與重吸收有關。