豬脂肪沉積相關的MicroRNA研究進展

陳 輝

（華中農業大學農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，農業農村部豬遺傳育種重點開放實驗室，湖北 武漢 430070）

豬肉是國人主要的食用肉類，而隨著人民生活水平的提高，對優質豬肉的需求也隨之增加。由于前期人們對瘦肉型豬的高強度選擇，使得豬肉的風味和多汁性等品質下降[1]，而脂肪沉積是影響豬肉品質（風味和多汁性等）的主要因素。MicroRNA（miRNA）最早是在1993年由Lee等在秀麗隱桿線蟲中發現的，研究發現了一種可以與Line4基因的3'非翻譯區（3'UTR）形成互補序列從而抑制該基因的翻譯，這是MicroRNA首次被發現的標志[2]。miRNA是長度約為 22 nt（18～24nt）的內源性小分子RNA，在動植物機體通過靶向目的基因致使基因表達受阻，從而實現對動植物機體的各項生命活動（脂肪細胞增殖分化等過程）進行調控[3]。有關miRNA的相關研究主要集中在人上，筆者通 過 MicroRNAs（miRNA） 數 據庫（http://www.mirbase.org/） 檢 索了人（Human）相關miRNA，截止到目前，已有2 815條miRNA數據；筆者同樣檢索了豬（swine）相關miRNA，結果僅為219條相關miRNA數據，而與豬脂肪沉積相關的miRNA數據就更少了，因而需要進一步深入挖掘和鑒定豬脂肪沉積相關的miRNA。研究表明，miR-27[4]、miR-34[5]、miR-125[6]以及miR-130[7]等miRNA家族可通過靶向目的基因實現對豬脂肪沉積進行調控，故就4個miRNA在豬脂肪沉積中的調控進行綜述，同時分析了miRNA的形成及作用機制，旨在為進一步深入挖掘和鑒定與豬脂肪沉積相關miRNA提供理論依據和思路，進而為豬肉品質的遺傳改良提供策略和方向。

1 miRNA的形成及其作用機制

1.1 miRNA的形成過程

豬miRNA是在細胞核經RNA聚合酶Ⅱ（RNA Pol II）的轉錄產物[8]。具體形成過程分為3步。第一步是miRNA基因通過RNA Pol II的轉錄形成初級具有發卡結構的轉錄物（pri-miRNA）；第二步是通過RNase核酸內切酶III（DROSHA）將pri-miRNA加工形成前體miRNA（pre-miRNA），產生的pre-miRNA（具有二級莖環結構）通過核蛋白（Exportin-5，一種GTP依賴性轉運蛋白）轉運至細胞質；最后一步即是通過Dicer酶（一種RNA聚合酶III）和TRBP（RNA結合蛋白）和PACT進行切割形成雙鏈miRNA，至此成熟的miRNA加工形成。其具體形成過程見圖1[9]。

1.2 miRNA的作用機制

圖1 miRNA的形成過程

miRNA主要是形成沉默復合物（RISC）后，用于種子序列靶向目的基因從而抑制基因的表達。在細胞核加工形成雙鏈miRNA，此時的miRNA可以形成活性RNA誘導形成沉默復合物（RISC），RISC中包含的Argonaute 2蛋白（Ago2）是RISC的關鍵催化酶，一旦Ago2與RISC結合，目的基因的3'UTR將會被miRNA的5'末端的互補序列（稱為種子序列，由于種子序列多為6～8 nt，因而一種miRNA可靶向多種基因，同理基因也可被多種miRNA靶向）識別并結合，從而阻止其翻譯過程，使靶基因mRNA沉默[8]。

2 豬脂肪沉積相關miRNA

2.1 miR-27家族

miR-27家族包括miR-27a、miR-27b以及miR-27c，研究發現miR-27家族通過靶向脂蛋白酶（LPL）基因，對LPL的表達進行抑制，從而降低了脂肪沉積相關基因的表達，最終抑制了脂肪的沉積，對豬肉品質的改善具有消極作用[10]。研究表明，miR-27在脂肪組織的表達量顯著降低（P＜0.05），豬皮下脂肪中miR-27的表達與脂肪沉積標志基因過氧化物酶增殖物激活受體（PPARγ）-γ以及脂肪酸結合蛋白4（FABP4）的表達呈顯著負相關（P＜0.05），這表明miR-27對脂肪沉積具有抑制作用[11]。關于miR-27a的研究，有研究發現miR-27a在藏豬背最長肌的表達量極顯著高于在大白豬中的表達量（P＜0.01），相關性分析表明，miR-27a的表達量與IMF含量呈負相關關系[12]。相似的研究報道，miR-27a在豬背部皮下脂肪的表達水平與背膘厚以及單不飽和脂肪酸呈負相關關系，而與胴體瘦肉率呈顯著正相關，表明miR-27a對豬脂肪沉積具有抑制作用，而有助于改善豬胴體性能[13]。但也有關于miR-27a正調控脂肪沉積的研究，Li等[4]研究發現，在沂蒙黑豬中，背膘較厚的個體中miR-27a具有更高的表達量；楊雪梅等[14]采用熒光定量PCR技術（Q-PCR）探討了miR-27a的表達量與我國地方豬種肉質性狀（風味物質）的關系，結果表明miR-27a的表達量與地方豬種肌內脂肪（IMF）含量呈正相關關系，這表明miR-27a對肉質性狀具有正調控作用，造成差異的原因可能是品種原因。在miR-27b的研究方面，研究發現miR-27a和miR-27b在皮下脂肪細胞的表達量顯著高于肌內脂肪細胞的表達量（P＜0.05），進一步分析表明，miR-27b能夠靶向PPARγ基因，從而抑制其表達，降低脂肪的沉積[15]。綜上表明，miR-27家族通過靶向脂肪沉積相關基因從而對脂肪沉積具有抑制作用，對豬肉品質具有負調控作用。

2.2 miR-34家族

miR-34家族主要包括miR-34a、miR-34b以及miR-34c，在豬上研究較多的為miR-34a和miR-34c，故本文主要論述miR-34a和miR-34c在豬脂肪沉積中作用。有關miR-34a的研究較多，研究發現，miR-34a過表達增加了肝臟中甘油三脂的含量，轉錄調控分析表明，miR-34a通過靶向豬脂聯素受體2基因（AdipoR2）的3'UTR抑制和AMPK信號途徑來抑制PPARα信號傳導途徑而增加脂肪的含量[5]。李秀秀[16]采用猝滅螢火蟲熒光素酶方法確定了miR-34a的種子序列與長鏈酯酰輔酶A合成酶4(ACSL4)基因的靶向關系，細胞增殖分化分析表明，miR-34a靶向ACSL4基因從而抑制其表達，進而促進脂肪細胞的增殖分化，從而使脂肪細胞脂滴含量增加。但也有miR-34a負調控脂肪沉積的研究報道，Sun等[17]研究了miR-34a與人血小板衍生生長因子受體α（PDGFRα，PDGFRα通過激活Erk信號通路促進脂肪形成分化）的靶向關系，發現miR-34a可以通過靶向PDGFRα，抑制其表達，從而抑制脂肪的生產。在miR-34c與脂肪沉積中的研究中，陳粉粉[18]研究miR-34c對豬肌內脂肪細胞增殖分化的影響，研究發現，過表達miR-34c后，發現肌內脂肪細胞分化標志基因PPARγ、FABP4和FASN基因的轉錄水平（mRNA）被極顯著下調，蛋白印跡得到了類似的結果；流式分析表明，過表達miR-34c抑制了肌內脂肪細胞的增殖；最終抑制了豬脂肪的沉積，表明miR-34c對脂肪沉積具有負調控作用。

2.3 miR-125家族

miR-125a是miR-125家族的主要成員，也是一種豬脂肪沉積的抑制因子，通過抑制脂肪細胞的增殖分化而抑制脂肪的沉積。Du等[6]miR-125a可以直接靶向kruppel 3因子（KLF13），從而抑制豬肌內前脂肪細胞的分化，同時研究發現miR-125a的表達量與IMF含量呈負相關；過表達miR-125a降低了總飽和脂肪酸（SFA）含量和單不飽和脂肪酸（MUFA）/ SFA比率。在對鼠的研究表明，miR-125a可能促進3T3-L1前脂肪細胞增殖而通過負調節STAT3抑制3T3-L1前脂肪細胞分化[19]。Ji等[20]研究表明，過表達miR-125a后會顯著降低成脂標志基因PPARγ，LPL和aP2的mRNA表達水平；油紅O染色分析表明，過表達后miR-125a顯著降低了脂質的積累；通過靶向分析，miR-125a可靶向ERRα基因從而抑制豬脂肪細胞的分化。可抑制細胞的增殖分化而實現對脂肪沉積的負調控，Song等[21]發現，miR-125a可靶向轉錄因子E2F3的3'UTR，從而負調控E2F3的表達，過表達miR-125a后發現C2C12成肌細胞的增殖被抑制，最終降低了脂肪的沉積。相似的研究發現，過表達miR-125a后會導致脂滴降低，成脂標志基因PPARγ和aP2的表達量以及翻譯水平均下調，同時過表達miR-125a顯著抑制了豬前體脂肪細胞的分化；而抑制miR-125a則得到了相反的結果（促進了脂肪前體細胞的分化）[22]。表明，miR-125a通過靶向成脂標志基因而抑制脂肪細胞的增殖分化，從而對豬脂肪的沉積起負調控作用。

2.4 miR-130家族

miR-130家族也是一種脂肪沉積的抑制因子，該家族主要包括miR-130a和miR-130b兩大類。在miR-130a與豬脂肪沉積的研究方面，wei等[7]研究了肌內脂肪（IM）和皮下脂肪（SC）之間PPARγ的表達水平差異，結果發現IM中的PPARγ的mRNA和蛋白質水平均顯著低于SC，而IM中的miR-130a的表達水平為SC的2.30倍，因此作者進一步通過雙熒光素酶活性方法探討miR-130a和PPARγ的表達關系，結果表明miR-130a直接靶向PPARγ，抑制其表達，進而造成IM中的脂肪沉積水平低于SC。miR-130a還可通過靶向成脂標志基因而抑制脂肪細胞分化，據李虹儀等[23]報道，將miR-130a類似物（miR-130a mimics）轉染至豬皮下脂肪前體細胞后連續誘導8 d，與陰性（亂序序列）對照相比，miR-130a mimics組細胞脂滴減少，甘油三酯（TAG）含量顯著降低，脂肪細胞分化標志基因LPL和PPARγ的表達量均顯著下調（P＜0.05）；而加入miR-130a類抑制物后，細胞脂滴和TAG含量增加，這表明miR-130a可靶向多個基因以實現對脂肪細胞分化的調控。miR-130b也可通過靶向PPARγ等基因來抑制脂肪的沉積，Pan等[24]發現miR-130b可以直接靶向PPARγ基因，降低其mRNA水平，從而抑制豬脂肪的沉積。也有研究通過雙熒光素酶活性方法測定了miR-130b的表達與PPARγ、C / EBP-β3 等成脂基因的 3，UTR，抑制目的基因的表達，研究結論認為miR-130b對母豬及其仔豬的脂肪沉積起負調控作用[25]。綜上表明，miR-130家族通過靶向成脂相關基因，進而抑制脂肪細胞的增殖分化，最終對豬脂肪沉積進行負調控。

2.5 其他脂肪沉積相關miRNA

除了上述與豬脂肪沉積相關的miRNA外，還有miR-17-5p、miR-103、miR-199-5p、miR-425p以 及miR-7134-3p等miRNA參與了豬脂肪沉積的負調控。研究發現過表達miR-17-5p會顯著抑制豬前脂肪細胞 NCOA3、PPARγ以及FABP4基因的表達（P＜0.05），同時顯著降低TAG的含量（P＜0.05）；而抑制miR-17-5p表達則結果相反，研究認為miR-17-5p通過靶向NCOA3基因來抑制豬脂肪的沉積[26]。Shi等[27]發現miR-199-5p是通過靶向caveolin-1（Cav-1）來調控豬脂肪細胞的分化；Chen等[28]發現miR-425p可以靶向KLF13，下調PPARγ基因的表達進而抑制豬肌內脂肪的形成；Wang等[29]發現MARK4基因是miR-7134-3p的靶基因，通過抑制基因的表達進而抑制閹豬的脂肪沉積。上述miRNA均是脂肪沉積的負調控因子，而研究表明miR-103具有促進豬脂肪沉積的作用，Li等[30]研究表，過表達miR-103后會促進脂肪細胞的分化，增加誘導8 d后的脂滴積累，同時促進成脂標志基因PPARγ基因、aP2基因的表達量，研究認為PPARγ基因有助于豬原代脂肪細胞中的脂肪沉積，從而對豬脂肪沉積起正調控作用。

3 小結與展望

通過全文可知，miRNA通過種子序列靶向目的基因的3，UTR，進而從轉錄后水平對目的基因的表達進行抑制，實現對基因表達的調控。miR-27、miR-34、miR-125以及miR-130家族參與了豬的脂肪沉積 調 控，miR-27、miR-125、miR-130家族為脂肪沉積的負調控因子，miR-34a以及miR-103則是豬脂肪沉積的促進因子，這豐富了miRNA在豬脂肪沉積中的研究，為豬肉品質的遺傳改良提供了新的策略和思路。盡管miRNA在脂肪調控中具有重要調控作用，但有關miRNA在豬脂肪調控方面的研究卻鮮有報道；同時大部分miRNA相關研究只是復制人或小鼠的實驗結果，并未進行深入系統的研究，部分文章雖然論述了miRNA通過靶向脂肪沉積相關基因，但卻缺乏科學合理的實驗設計；總之，與miRNA在人和鼠上的研究相比，miRNA調控豬脂肪沉積方面的研究遠遠不夠[31]。但相信隨著分子生物技術、豬遺傳改良技術的發展，科學家將會對miRNA調控豬脂肪沉積方面的研究進行更加深入系統的研究，同時鑒定出更多的與脂肪沉積相關miRNA，從而豐富miRNA的相關研究，也為豬肉品質的遺傳改良提供新的策略和思路。