江蘇省豬偽狂犬病流行病學(xué)調(diào)查及兩種疫苗免疫效果評估

佘志成，李 群，王 凱，郎秀艷，宋慶慶*

（1.金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030；2.揚(yáng)州優(yōu)邦生物藥品有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225008）

偽狂犬病是一種由偽狂犬病毒感染引起的多種家畜和野生動物共患的急性、熱性傳染病，除豬以外的其他動物均呈致死性感染，豬是偽狂犬病毒的唯一自然宿主。我國于20世紀(jì)70年代由哈爾濱獸醫(yī)研究所從匈牙利引進(jìn)了偽狂犬疫苗Bartha-k61株，自20世紀(jì)90年代以來國內(nèi)規(guī)模化豬場普遍使用該基因缺失疫苗，使豬偽狂犬病得到了很好的控制。但是2011年以后，一種由偽狂犬病毒變異毒株引起的豬偽狂犬病在我國暴發(fā)，造成大量母豬繁殖障礙、100%初生乳豬死亡率以及育肥豬嚴(yán)重的呼吸道問題，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損[1-3]。

本實(shí)驗(yàn)通過間接 ELISA 方法檢測豬群中的 gE 抗體來鑒定豬群是否被偽狂犬病野毒感染，對豬偽狂犬病gE陰性場檢測 gB 抗體來判定豬群的豬偽狂犬病抗體保護(hù)水平，由此系統(tǒng)調(diào)查分析江蘇地區(qū)豬偽狂犬病的流行情況，并在一存欄1 000頭左右經(jīng)產(chǎn)母豬的豬偽狂犬病陽性豬場嘗試使用最新上市的變異株活疫苗與抗原含量最高的進(jìn)口產(chǎn)品相比控制豬偽狂犬病效果，通過檢測豬偽狂犬病gE，gB抗體及中和抗體評估偽狂犬病的控制效果，為進(jìn)一步開展豬偽狂犬病的綜合防治以及豬偽狂犬病凈化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

被檢血清樣品共4 608份，從2017年5月至2019年1月采集自江蘇地區(qū)59個規(guī)模化豬場，其中種豬群1 521份樣品、仔豬群1 901份樣品、育肥豬群896份樣品，后備豬群290份樣品分別檢測豬偽狂犬病gE、gB抗體。

1.2 試劑及儀器

豬偽狂犬病gE抗體ELISA試劑盒（西班牙Hipra）和豬偽狂犬病gB抗體檢測試劑盒（荷蘭BioChek）均購自北京天之泰生物科技有限公司；Eppendorf 移液器、酶標(biāo)儀、生化培養(yǎng)箱、洗板機(jī)、TGL-16G 高速臺式離心機(jī)、二氧化碳培養(yǎng)箱、渦旋振蕩器；偽狂犬病變異毒株YB-1、偽狂犬病經(jīng)典毒株HB-G株，ST細(xì)胞由揚(yáng)州優(yōu)邦生物藥品有限公司保存。兩種疫苗均為商品化疫苗，A 組疫苗為進(jìn)口產(chǎn)品，毒株為 Barth-K61 株，批號L447801；B 組疫苗為國內(nèi)分離雙基因缺失株C株，江蘇某公司生產(chǎn)，批號17251001。

1.3 疫苗免疫

疫苗免疫實(shí)驗(yàn)自2018年7月至2019年1月，在江蘇地區(qū)一存欄1 000頭左右母豬場進(jìn)行，該場在本次流行病學(xué)調(diào)查中判斷為豬偽狂犬病陽性活躍場，實(shí)驗(yàn)分A、B組進(jìn)行，免疫程序?yàn)樾律胸i滴鼻1頭份，10周齡、14周齡、18周齡肌肉注射1頭份；首次肌肉注射時A組408頭，B組435頭。

1.4 ELISA及中和抗體檢測

兩實(shí)驗(yàn)組分別在4周齡、6周齡、10周齡、14周齡、18周齡、20周齡、24周齡采血，分離血清ELISA檢測兩組gE、gB抗體，檢測兩組14周齡、18周齡血清測中和抗體。

1.5 測定偽狂犬病毒效價（TCID50）

ST細(xì)胞培養(yǎng)至單層后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液；將收獲病毒樣品用DMEM無血清培養(yǎng)基按照10倍稀釋度連續(xù)倍比稀釋到10-9，將不同稀釋度的毒液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個濃度做8個重復(fù)孔，每孔100 μL，吸附1 h后，加入維持液；培養(yǎng)96 h后，觀察細(xì)胞病變（CPE），記錄每個稀釋度的CPE數(shù)量，按照Reed-muench方法計算TCID50。

1.6 中和抗體測定

病毒液稀釋至200 TCID50備用；取1新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板作為稀釋板，A1-G1孔加入200 μL血清樣品（血清稀釋度1:2），其余每孔加入100 μL DMEM液，從A1孔取100 μL毒液至A2孔混勻后，再向A3孔加入100 μL混合液，按照上述方法依次倍比稀釋至第10孔，剩余兩孔設(shè)為病毒對照孔和陰性對照孔，將各血清稀釋孔和病毒對照孔加入 100 μL 200 TCID50病毒液，陰性對照孔則加入100 μL DMEM液，37 °C孵育1 h后；將鋪有ST細(xì)胞的96孔板，棄去細(xì)胞液，將稀釋板上液體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞板，培養(yǎng)96 h后觀察CPE，以最高稀釋度CPE作為中和抗體效價。另做回歸實(shí)驗(yàn)，將病毒做1、10、100、1 000倍的稀釋，將稀釋后的病毒液加入細(xì)胞板中，每孔100 μL，每個稀釋度做6個重復(fù)孔，另外設(shè)6個對照孔，只加入DMEM，若100倍稀釋毒孔有半數(shù)出現(xiàn)CPE，則實(shí)驗(yàn)成立。

2 結(jié)果

2.1 豬偽狂犬病 gE 抗體檢測情況

2017年5月份至2019年1月份從江蘇地區(qū)59個規(guī)模場進(jìn)行采樣檢測，抽檢了4 608份樣品，gE抗體陽性樣品數(shù)1 681份，總體陽性率達(dá)到36%，進(jìn)一步分析母豬群1 396份樣品中有642份陽性，公豬125份樣品中g(shù)E抗體陽性62份，種豬群的陽性率近50%，大于120日齡的育肥豬群樣品896份，其中g(shù)E陽性252份，gE陽性率達(dá)28%（見表1），提示江蘇地區(qū)豬偽狂犬病感染較嚴(yán)重，種豬群感染率高于商品豬群，這些豬場均是進(jìn)行豬偽狂犬病疫苗免疫的豬場，但未能很好地控制偽狂犬病毒的感染。

根據(jù)《豬病學(xué)》第9版，豬偽狂犬病母源抗體持續(xù)期為4個月，由于母豬一旦感染終生帶毒，母豬及仔豬的gE抗體并不能完全代表豬場偽狂犬病毒的感染情況，為準(zhǔn)確評估豬場偽狂犬病的控制效果，我們進(jìn)一步對各個豬場商品豬的gE抗體也進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)對于每個豬場根據(jù)母豬群gE陽性與否以及商品豬陽性與否的情況對豬場偽狂犬病感染情況進(jìn)行細(xì)分，發(fā)現(xiàn)豬場母豬及商品豬均陽性的場比例達(dá)37%（見表2）。另對本地區(qū)8個豬偽狂犬病gE陰性場的gB抗體情況進(jìn)行檢測分析，總體gB陽性率為74%，其中主要問題在于育肥豬階段合格率偏低只有62%（見表3），是主要的免疫漏洞所在。

2.2 豬偽狂犬病防控實(shí)驗(yàn)前免疫程序調(diào)整

在豬偽狂犬病流行病學(xué)調(diào)查中，與江蘇一規(guī)模豬場場主進(jìn)行溝通，其表現(xiàn)強(qiáng)烈地控制本場豬偽狂犬病問題的想法，基于此，制定了該場的豬偽狂犬病防控方案，該場之前使用國產(chǎn)HB2000株豬偽狂犬病疫苗未能很好解決場內(nèi)豬偽狂犬病問題，檢測母豬群陽性率gE抗體陽性率95%，商品豬偽狂犬病gE陽性率100%（見表4），實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了一次母源抗體調(diào)查（見表5），對豬偽狂犬病免疫程序調(diào)整為出生24 h內(nèi)滴鼻，10周齡、14周齡、18周齡3次肌肉注射。

2.3 豬偽狂犬病防控實(shí)驗(yàn)結(jié)果評估

該實(shí)驗(yàn)于2018年7月26日開始，實(shí)驗(yàn)兩組分別接種A疫苗與B疫苗于4周齡、6周齡、10周齡、14周齡、18周齡、20周齡、24周齡采血，最后一次采血為2019年1月15日，所采血樣分別檢測gE、gB抗體，兩組在18周齡后gE抗體均為陰性，表明仔豬4～14周齡gE抗體陽性均為母源抗體持續(xù)，非感染產(chǎn)生，且18周齡后gB抗體陽性率均為100%（見表6），此時的gB抗體為疫苗免疫產(chǎn)生，提示疫苗均產(chǎn)生了較好的保護(hù)，相比之前豬偽狂犬病得到了較好的控制。

2.4 中和抗體檢測結(jié)果

中和抗體是評判豬偽狂犬病疫苗免疫效果的金標(biāo)準(zhǔn)，但是檢測中和抗體費(fèi)時費(fèi)力，不適合大批量檢測，本實(shí)驗(yàn)選取首免后4周，二免后4周測中和抗體，比較兩組差異，檢測結(jié)果表明二免后4周B組無論是對變異株還是經(jīng)典株，中和抗體均優(yōu)于A組（見表7）。

表1 江蘇地區(qū)豬偽狂犬病 gE 抗體檢測情況

表2 江蘇地區(qū)豬場偽狂犬病gE陽性比例

表3 江蘇地區(qū)8個豬偽狂犬病毒gE陰性豬場的gB抗體情況

3 討論

隨著變異株豬偽狂犬病毒的出現(xiàn)，傳統(tǒng)疫苗的保護(hù)效率在下降，全國各地流行病學(xué)調(diào)查均發(fā)現(xiàn)自2011年以后豬群中豬偽狂犬病毒gE抗體的比例明顯上升，同時各地均分離到豬偽狂犬病毒變異毒株[4-9]。對江蘇地區(qū)規(guī)模化豬場gE抗體調(diào)查發(fā)現(xiàn)，樣品總體gE陽性率達(dá)36%，其中種豬群的gE陽性率達(dá)到50%，相比全國平均水平，江蘇地區(qū)豬偽狂犬病感染壓力較大。豬只一旦感染偽狂犬病病毒可終生帶毒，而仔豬母源抗體半衰期為18 d，母源抗體最長持續(xù)期可達(dá)4個月，因此對于母豬群已經(jīng)是gE陽性的父母代豬場，如何有效防控和正確的評估偽狂犬病的防控效果尤為重要，必須要檢測120日齡以后商品豬群的偽狂犬病gE抗體情況。本次調(diào)查也對各豬場育肥豬群gE抗體情況進(jìn)行了解，育肥豬群gE抗體陽性占總育肥豬群的比例達(dá)到28%，育肥后期豬群gE抗體陽性的豬場占比達(dá)到37%，江蘇地區(qū)的豬場血清調(diào)查揭示即使免疫了豬偽狂犬病疫苗，育肥豬群的防控效果仍不容樂觀。

表4 實(shí)驗(yàn)前豬偽狂犬病血清樣品gE、gB抗體調(diào)查

表5 豬偽狂犬病母源抗體檢測

表6 注射兩種疫苗后產(chǎn)生gE、gB抗體比較

表7 中和抗體檢測

在gE抗體陰性的情況下，gB 免疫抗體陽性率與其中和抗體效價有一定的相關(guān)性，gB–ELISA 抗體水平可以用來評估生豬對當(dāng)前流行 PRV 毒株的相對免疫保護(hù)力[9-10]，在江蘇8個gE陰性的豬場我們檢測發(fā)現(xiàn)育肥豬階段gB抗體陽性率62%，且S/P值相對較低，提示育肥階段為豬偽狂犬病防控一大薄弱環(huán)節(jié)，需要引起重視。

豬偽狂犬病病毒C株是國內(nèi)新近分離到的偽狂犬病毒變異株，同豬偽狂犬病病毒Bartha-k61同源性為95%～96%，與PRV Bartha-k61不屬同一個毒株[11]。中和抗體檢測是評估免疫效果的金標(biāo)準(zhǔn)，gB抗體只是中和抗體的一種，且一般認(rèn)為中和抗體大于1:2時對應(yīng)ELISA檢測gB抗體水平即為陽性，ELISA檢測的gB抗體S/P值與中和抗體有一定相關(guān)性，為更好地評估疫苗的豬場使用效果，在檢測gB抗體的基礎(chǔ)上可進(jìn)一步進(jìn)行中和抗體的檢測。我們在一豬偽狂犬病陽性的豬場進(jìn)行了兩組疫苗的防控效果評價，兩組在相同的免疫程序下育肥階段18周齡以后至出欄前均保持gE抗體陰性，gB抗體陽性率100%，達(dá)到了較好的控制效果，進(jìn)一步于首免后4周，二免后4周檢測中和抗體發(fā)現(xiàn)B組在二免后無論是對經(jīng)典株還是變異株的中和抗體效價均優(yōu)于A組，差異顯著。中和抗體效價越高，對病毒的中和效果越好，對于豬偽狂犬病陽性豬場，在充分了解豬群感染情況及母源抗體消減的情況下，選擇優(yōu)質(zhì)的疫苗進(jìn)行科學(xué)免疫能產(chǎn)生更高的中和抗體，取得較好的偽狂犬病控制效果為進(jìn)一步凈化豬偽狂犬病提供基礎(chǔ)。