某規(guī)?；i場(chǎng)暴發(fā)仔豬輪狀病毒感染致腹瀉的診斷

郭倩妤，湯德元*，石遠(yuǎn)菊，葉 麗，楊 偉，廖少山，張 森

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025）

2019年3月下旬，貴州省銅仁市某規(guī)?；i場(chǎng)約2周齡仔豬出現(xiàn)精神沉郁、食欲減退、水樣腹瀉等癥狀，用慶大霉素、氟哌酸等藥物治療后不見(jiàn)任何好轉(zhuǎn)，發(fā)病3～5 d后部分發(fā)病仔豬脫水死亡，疑為病毒性腹瀉。于是隨機(jī)采集了9份發(fā)病豬肛門拭子和發(fā)病豬1頭送我院臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行診斷檢測(cè)，通過(guò)對(duì)該豬場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查、送檢的發(fā)病豬臨床癥狀觀察、病理解剖診斷和對(duì)豬輪狀病毒（PoRV）、豬流行瀉病毒（PEDV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）及豬德?tīng)査跔畈《荆≒DCoV）毒的RT-PCR檢測(cè)，確診導(dǎo)致該豬場(chǎng)大量仔豬腹瀉死亡的原因?yàn)樨i輪狀病毒感染。現(xiàn)將診斷檢測(cè)結(jié)果報(bào)告如下。

1 發(fā)病情況及病料的采集

該豬場(chǎng)有5窩仔豬突然出現(xiàn)食欲減退、嘔吐、粥樣或水樣腹瀉、精神沉郁、互相擁擠、喜扎堆等癥狀，同一圈舍內(nèi)的仔豬相繼發(fā)病，出現(xiàn)相同癥狀，個(gè)別哺乳母豬出現(xiàn)了一過(guò)性的腹瀉。隨著病程發(fā)展，發(fā)病仔豬消瘦，日齡較小的發(fā)病仔豬逐漸食欲廢絕、嚴(yán)重水樣腹瀉進(jìn)而脫水死亡。發(fā)病仔豬排泄物呈黃色或白色，偶見(jiàn)未消化完全的凝乳塊，有惡臭氣味。

樣品采集使用棉拭子在生理鹽水中浸濕，插入待采樣仔豬的肛門2～3 cm，使用棉拭子在肛門內(nèi)輕輕擦涂，然后將棉拭子放入盛有生理鹽水的1.5 mL EP管內(nèi)。完成采集后，將采集到的樣品放入有冰袋的保溫采樣箱內(nèi)盡快送往實(shí)驗(yàn)室。

2 臨床癥狀

送檢發(fā)病仔豬消瘦、臥地不起、極度衰弱、眼窩下陷、發(fā)抖、四肢偶有抽動(dòng)，肛門附近粘有黃色糞便，按壓皮膚回彈時(shí)間較慢，心率約150次/min，體溫為36 ℃，呼吸為30次 /min。

3 剖檢變化

發(fā)病仔豬剖檢可見(jiàn)腸道充血、脹氣、腸管擴(kuò)張呈半透明狀，腸系膜淋巴結(jié)腫大、充血，胃內(nèi)充滿未消化的凝乳塊。

4 四種腹瀉病毒的RT-PCR檢測(cè)

根據(jù)豬群的發(fā)病特征，對(duì)送檢的樣品分別進(jìn)行了PoRV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR檢測(cè)，以便確診該豬場(chǎng)仔豬發(fā)生腹瀉的病因。

4.1 核酸提取

拭子樣品使用磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行稀釋，使棉拭子上附著的病料充分懸浮于PBS稀釋液中，然后將稀釋液移入新的1.5 mL EP管中并編號(hào)。腸及內(nèi)容物等病料研磨后反復(fù)凍融3次，再用勻漿器研磨20 min后收集勻漿。12 000 r/min 離心 10 min，取上清液，用 TaKaRa Min BEST Viral DNARNA Extraction Kit Ver.5.0 試劑盒分別提取總核酸。

4.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中已登錄的PoRV VP7（KU886318.1）、PEDV（MH061337.1）、TGEV（KP202848.1）、PDCoV（MH715491.1） 基 因序列，應(yīng)用GenBank中自帶的Primer BLAST功能、DNAStar等軟件各設(shè)計(jì)了一對(duì)上、下游引物（見(jiàn)表1），用于擴(kuò)增相應(yīng)目的基因片段，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

4.3 RT-PCR反應(yīng)

分別進(jìn)行PoRV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)體系（25 μL）為2×1 step buffer 12.5 μL，核酸模板2 μL，上、下游引物（表1）各1 μL，Prime Script One Step Enzyme Mix 1μL，RNase Free H2O補(bǔ)充至25μL；反應(yīng)程序?yàn)?0 ℃ 40 min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；55 ℃ 45 s；72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL 產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后經(jīng)凝膠成像儀拍照記錄，結(jié)果見(jiàn)圖1。其檢測(cè)結(jié)果顯示：檢測(cè)出1 062條帶，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期條帶相符，表明發(fā)病仔豬為豬輪狀病毒感染。

表1 擴(kuò)增目的基因的引物及片段大小

5 結(jié)果及討論

根據(jù)仔豬發(fā)病情況、臨床癥狀和樣品RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，導(dǎo)致該豬場(chǎng)仔豬發(fā)生腹瀉甚至死亡的病因?yàn)樨i輪狀病毒感染，將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，該序列為A群輪狀病毒VP7基因的部分序列。

確診后及時(shí)采取有效措施，避免輪狀病毒的場(chǎng)內(nèi)擴(kuò)散：對(duì)產(chǎn)前母豬緊急接種弱毒疫苗，臨產(chǎn)母豬轉(zhuǎn)入已消毒滅菌的單獨(dú)產(chǎn)房，及時(shí)淘汰脫水嚴(yán)重的發(fā)病仔豬；初產(chǎn)豬進(jìn)行2次以上的免疫，并在免疫2 周后監(jiān)測(cè)抗體水平，若抗體水平不足，應(yīng)在7 d 后再次免疫；已感染的仔豬及哺乳母豬嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)，可在飲用水中適當(dāng)補(bǔ)充電解質(zhì)液，料槽中可拌入蒙脫石散類吸附劑；未發(fā)病的仔豬可由人工喂養(yǎng)，或經(jīng)擦洗消毒后由同產(chǎn)房未發(fā)病的健康母豬喂養(yǎng)；將污染圈舍、器具、設(shè)備進(jìn)行徹底消毒，并將污染物、淘汰豬、病死豬進(jìn)行無(wú)害化處理，嚴(yán)格防止病毒進(jìn)一步擴(kuò)散；加強(qiáng)日常飼養(yǎng)的管理，調(diào)整、加強(qiáng)待產(chǎn)母豬的日糧，滿足其營(yíng)養(yǎng)需求；飼養(yǎng)環(huán)境方面應(yīng)當(dāng)保持產(chǎn)房和保溫箱的濕度、溫度穩(wěn)定；由于晝夜溫差較大，圈舍也應(yīng)當(dāng)根據(jù)氣溫及時(shí)進(jìn)行溫度管理。此外，在每年的疫病高發(fā)季節(jié)來(lái)臨前，還應(yīng)對(duì)母豬進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

仔豬腹瀉是規(guī)?；i場(chǎng)常見(jiàn)的疫病，其特點(diǎn)是發(fā)病豬精神沉郁、食欲減退、偶有嘔吐、嚴(yán)重腹瀉導(dǎo)致仔豬脫水死亡[1]。近年來(lái)，造成仔豬腹瀉的病毒性病原主要有PoRV、PEDV、TGEV、PDCoV等，這幾種病毒常呈單一或混合感染[1-4]。初產(chǎn)母豬所產(chǎn)仔豬相較于經(jīng)產(chǎn)母豬所產(chǎn)的仔豬更容易感染豬輪狀病毒，易于斷奶前后發(fā)病，成年豬感染后一般不出現(xiàn)臨床癥狀，但被感染母豬可能在圍產(chǎn)期排毒，成為感染源[5]。豬流行性腹瀉病毒在世界各地的豬場(chǎng)中普遍存在，仔豬感染后死亡率很高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。豬傳染性胃腸炎可感染全年齡段的豬，但臨床癥狀可能不同，10 d左右的仔豬被感染后，發(fā)病死亡率較高[7]。豬德?tīng)査跔畈《居?012年在中國(guó)香港首次被報(bào)道，主要危害新生仔豬[8]。由于上述病毒感染發(fā)病在臨床癥狀上極為相似，常需要使用實(shí)驗(yàn)室診斷方法輔助診斷。

圖1 棉拭子PDCoV、PoRV RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

豬輪狀病毒是一種能夠引起豬急性傳染性腸道疾病的重要病毒性病原，該病毒對(duì)1～8周齡仔豬的感染力和致病力較強(qiáng)[9-10]，發(fā)病仔豬死亡率高。輪狀病毒導(dǎo)致的感染發(fā)病在大部分地區(qū)具有一定的季節(jié)性，多發(fā)于較為寒冷的如秋、冬和早春等時(shí)節(jié)[1]。由于該病在臨床癥狀上與其他病原造成的豬腹瀉很難區(qū)分，常需要借助實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)才能確定病原，所以文中將病料進(jìn)行了豬輪狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬德?tīng)査跔畈《镜腞T-PCR檢測(cè)，最終確定該豬場(chǎng)的發(fā)病豬為豬輪狀病毒的感染引起的。