某規?；i場暴發仔豬輪狀病毒感染致腹瀉的診斷

郭倩妤，湯德元*，石遠菊，葉 麗，楊 偉，廖少山，張 森

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

2019年3月下旬，貴州省銅仁市某規?；i場約2周齡仔豬出現精神沉郁、食欲減退、水樣腹瀉等癥狀，用慶大霉素、氟哌酸等藥物治療后不見任何好轉，發病3～5 d后部分發病仔豬脫水死亡，疑為病毒性腹瀉。于是隨機采集了9份發病豬肛門拭子和發病豬1頭送我院臨床實驗室進行診斷檢測，通過對該豬場流行病學調查、送檢的發病豬臨床癥狀觀察、病理解剖診斷和對豬輪狀病毒（PoRV）、豬流行瀉病毒（PEDV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）及豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）毒的RT-PCR檢測，確診導致該豬場大量仔豬腹瀉死亡的原因為豬輪狀病毒感染。現將診斷檢測結果報告如下。

1 發病情況及病料的采集

該豬場有5窩仔豬突然出現食欲減退、嘔吐、粥樣或水樣腹瀉、精神沉郁、互相擁擠、喜扎堆等癥狀，同一圈舍內的仔豬相繼發病，出現相同癥狀，個別哺乳母豬出現了一過性的腹瀉。隨著病程發展，發病仔豬消瘦，日齡較小的發病仔豬逐漸食欲廢絕、嚴重水樣腹瀉進而脫水死亡。發病仔豬排泄物呈黃色或白色，偶見未消化完全的凝乳塊，有惡臭氣味。

樣品采集使用棉拭子在生理鹽水中浸濕，插入待采樣仔豬的肛門2～3 cm，使用棉拭子在肛門內輕輕擦涂，然后將棉拭子放入盛有生理鹽水的1.5 mL EP管內。完成采集后，將采集到的樣品放入有冰袋的保溫采樣箱內盡快送往實驗室。

2 臨床癥狀

送檢發病仔豬消瘦、臥地不起、極度衰弱、眼窩下陷、發抖、四肢偶有抽動，肛門附近粘有黃色糞便，按壓皮膚回彈時間較慢，心率約150次/min，體溫為36 ℃，呼吸為30次 /min。

3 剖檢變化

發病仔豬剖檢可見腸道充血、脹氣、腸管擴張呈半透明狀，腸系膜淋巴結腫大、充血，胃內充滿未消化的凝乳塊。

4 四種腹瀉病毒的RT-PCR檢測

根據豬群的發病特征，對送檢的樣品分別進行了PoRV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR檢測，以便確診該豬場仔豬發生腹瀉的病因。

4.1 核酸提取

拭子樣品使用磷酸鹽緩沖液（PBS）進行稀釋，使棉拭子上附著的病料充分懸浮于PBS稀釋液中，然后將稀釋液移入新的1.5 mL EP管中并編號。腸及內容物等病料研磨后反復凍融3次，再用勻漿器研磨20 min后收集勻漿。12 000 r/min 離心 10 min，取上清液，用 TaKaRa Min BEST Viral DNARNA Extraction Kit Ver.5.0 試劑盒分別提取總核酸。

4.2 引物設計與合成

根據GenBank中已登錄的PoRV VP7（KU886318.1）、PEDV（MH061337.1）、TGEV（KP202848.1）、PDCoV（MH715491.1） 基 因序列，應用GenBank中自帶的Primer BLAST功能、DNAStar等軟件各設計了一對上、下游引物（見表1），用于擴增相應目的基因片段，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

4.3 RT-PCR反應

分別進行PoRV、PEDV、TGEV、PDCoV的RT-PCR檢測，檢測體系（25 μL）為2×1 step buffer 12.5 μL，核酸模板2 μL，上、下游引物（表1）各1 μL，Prime Script One Step Enzyme Mix 1μL，RNase Free H2O補充至25μL；反應程序為50 ℃ 40 min；95 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s；55 ℃ 45 s；72 ℃ 45 s，35個循環；72 ℃ 10 min。反應結束后，取5 μL 產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后經凝膠成像儀拍照記錄，結果見圖1。其檢測結果顯示：檢測出1 062條帶，測序結果與預期條帶相符，表明發病仔豬為豬輪狀病毒感染。

表1 擴增目的基因的引物及片段大小

5 結果及討論

根據仔豬發病情況、臨床癥狀和樣品RT-PCR檢測結果表明，導致該豬場仔豬發生腹瀉甚至死亡的病因為豬輪狀病毒感染，將擴增產物測序結果與GenBank中的序列進行比對后發現，該序列為A群輪狀病毒VP7基因的部分序列。

確診后及時采取有效措施，避免輪狀病毒的場內擴散：對產前母豬緊急接種弱毒疫苗，臨產母豬轉入已消毒滅菌的單獨產房，及時淘汰脫水嚴重的發病仔豬；初產豬進行2次以上的免疫，并在免疫2 周后監測抗體水平，若抗體水平不足，應在7 d 后再次免疫；已感染的仔豬及哺乳母豬嚴格隔離飼養，可在飲用水中適當補充電解質液，料槽中可拌入蒙脫石散類吸附劑；未發病的仔豬可由人工喂養，或經擦洗消毒后由同產房未發病的健康母豬喂養；將污染圈舍、器具、設備進行徹底消毒，并將污染物、淘汰豬、病死豬進行無害化處理，嚴格防止病毒進一步擴散；加強日常飼養的管理，調整、加強待產母豬的日糧，滿足其營養需求；飼養環境方面應當保持產房和保溫箱的濕度、溫度穩定；由于晝夜溫差較大，圈舍也應當根據氣溫及時進行溫度管理。此外，在每年的疫病高發季節來臨前，還應對母豬進行加強免疫。

仔豬腹瀉是規?；i場常見的疫病，其特點是發病豬精神沉郁、食欲減退、偶有嘔吐、嚴重腹瀉導致仔豬脫水死亡[1]。近年來，造成仔豬腹瀉的病毒性病原主要有PoRV、PEDV、TGEV、PDCoV等，這幾種病毒常呈單一或混合感染[1-4]。初產母豬所產仔豬相較于經產母豬所產的仔豬更容易感染豬輪狀病毒，易于斷奶前后發病，成年豬感染后一般不出現臨床癥狀，但被感染母豬可能在圍產期排毒，成為感染源[5]。豬流行性腹瀉病毒在世界各地的豬場中普遍存在，仔豬感染后死亡率很高，給養豬業帶來了很大的經濟損失[6]。豬傳染性胃腸炎可感染全年齡段的豬，但臨床癥狀可能不同，10 d左右的仔豬被感染后，發病死亡率較高[7]。豬德爾塔冠狀病毒于2012年在中國香港首次被報道，主要危害新生仔豬[8]。由于上述病毒感染發病在臨床癥狀上極為相似，常需要使用實驗室診斷方法輔助診斷。

圖1 棉拭子PDCoV、PoRV RT-PCR檢測結果

豬輪狀病毒是一種能夠引起豬急性傳染性腸道疾病的重要病毒性病原，該病毒對1～8周齡仔豬的感染力和致病力較強[9-10]，發病仔豬死亡率高。輪狀病毒導致的感染發病在大部分地區具有一定的季節性，多發于較為寒冷的如秋、冬和早春等時節[1]。由于該病在臨床癥狀上與其他病原造成的豬腹瀉很難區分，常需要借助實驗室診斷技術才能確定病原，所以文中將病料進行了豬輪狀病毒、豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬德爾塔冠狀病毒的RT-PCR檢測，最終確定該豬場的發病豬為豬輪狀病毒的感染引起的。