Gli-1在人腦膠質瘤中的表達及與Ki-67相關性研究

劉海英 張秋實 蘇旭明 張學新

河北醫科大學第四醫院神經外科 河北石家莊 050012

膠質瘤是人中樞神經系統常見惡性腫瘤，約占顱腦腫瘤的47%。其中多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是人中樞神經系統原發的高度惡性腫瘤，約占神經膠質瘤的60%，因其增殖迅速、高浸潤性及復發率高等特點導致患者預后很差，中位生存期約14.6 個月，5年生存率不超過10%[1]。因此，深入研究膠質瘤的發生、發展的分子機制，尋找其發生發展的規律，探究腫瘤相關分子機制是治療膠質瘤的一項重要手段。研究顯示SHH（Sonic Hedgehog）信號通路在胚胎發育尤其是神經系統發育中起到重要作用。不僅如此近年來研究也證明，SHH 信號通路在多種腫瘤如髓母細胞瘤、胃癌、肝癌、基底細胞癌、肺癌、前列腺癌等的發生發展中起重要作用[2-6]。

Glioma-associated oncogene 1（Gli-1）是一類含有鋅指結構的核轉錄因子，在多種生物學進程中發揮著關鍵作用[7-8]。以往的研究中顯示，Gli-1 是SHH 信號通路激活中不可缺少的一類轉錄因子，其表達程度可直接反應Shh 信號通路的激活狀況[6,9]。而在膠質瘤中SHH 信號通路及Gli-1 的表達情況目前尚顯有報道。不僅如此，Gli-1 與代表腫瘤惡性分化能力的Ki-67 蛋白的相關性研究更是GBM 發生發展機制研究中的一項短板。因此本研究旨在利用RT-PCR 及免疫組化技術，探究人腦膠質瘤中SHH 信號通路中核轉錄因子Gli-1 的表達情況，探尋膠質瘤的發生發展的相關機制，為臨床實踐提供一定的指導。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集我院神經外科自2014年5月至2017年5月資料完整的行開顱手術患者腫瘤標本，經病理證實為膠質瘤標本50 例。其中男性28 例，女性22 例。年齡17-72 歲，中位年齡47 歲；病理學分級依據2016年WHO 中樞神經系統腫瘤分類標準，Ⅰ級9 例，Ⅱ級12 例，Ⅲ級13 例，Ⅳ級16 例，其中Ⅰ級、Ⅱ級作為低級別腫瘤組，Ⅲ級、Ⅳ級作為高級別腫瘤組。選取同期因腦外傷手術患者非腫瘤腦組織10 例作為對照組。

1.2 試劑

兔抗人Gli-1 多克隆抗體（ABGENT 公司）、鼠抗人單克隆抗體Ki-67（武漢博士德生物工程有限公司）、SP9001 免疫組化檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術開發公司）、反轉錄試劑盒（Thermo 公司）。

1.3 RT-PCR

于NCBI 基因庫查找相應的基因mRNA 序列，應用 Oligo 5.0設計引物，返回NCBI，進行Primer-BLAST，采用特異性較好引物序列。引物序列由Invitrogen 公司合成（表1）。

1.4 免疫組織化學法檢測多形性膠質母細胞瘤及正常腦組織中Gli-1 及Ki-67 的表達

將取得的膠質瘤標本、非腫瘤腦組織經甲醛溶液固定后，石蠟包埋切片，梯度復水后3%過氧化氫(H2O2)室溫避光孵育30min，PBS 沖洗2 次，EDTA 熱修復后PBS 沖洗2 次，血清封閉液37℃溫箱封閉1h，吸取多余血清后滴加一抗(Ki67 1:100，Gli-1 1:100)，4℃孵育過夜。次日PBS 沖洗2 次，加入生物素標記的二抗，37℃溫箱孵育30min，PBS 沖洗2 次，加鏈酶卵白素工作液，37℃溫箱內孵育30min，PBS 沖洗2 次，DAB 顯色，復染。光鏡下觀察結果并拍照。

Gli-1 免疫組化表達均主要為細胞質及細胞核中，Ki67 免疫組化表達均主要為細胞核中。采用Friedrich 等的免疫反應評分（immunoreactivity score，IRS），采用半定量標準：高倍視野下隨機選取5 個視野，計數200 個細胞，陽性細胞≤10%為0 分；＞10%-50%為1 分；＞50%-75%為2 分；＞75%為3 分。染色強度標準：無色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。總體評價：以上述2 項得分相乘：0 分判為“-”，1 分～4 分判為“+”，5 分～7 分判為 “++”，≥8 分判為“+++”。以“++”和“+++”定義為陽性，“－”和“+”定義為陰性。

1.5 RT-PCR 檢測多形性膠質母細胞瘤及正常腦組織中Gli-1mRNA 及Ki-67 的表達

將手術取下的各腫瘤組織及非腫瘤腦組織半小時內放入無菌、無酶凍存管，存至-80℃冰箱。組織標本在研缽中碾碎，用TriQuick 總RNA 提取試劑提取組織總R NA，反轉錄試劑盒獲得cDNA，20μl 反應體系進行RT-PCR 反應[Mix 10μl，上游引物 (5μM)0.4μM，下游引物 (5μM) 0.4μM，cDNA 0.4μg，去離子水至20μl]。反應條件：95℃5min，95℃ 30s，56 ℃（Ki-67）/58 ℃（Gli-1）/57℃（GAPDH）30s，72℃ 45s，72℃ 7.5min (35 個循環)。產物經瓊脂糖凝膠電泳后分別測定樣本基因及對應內參灰度值，以灰度值進行統計學比較。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0 統計軟件進行統計學處理，計數資料采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法；計量資料以()表示，組間比較采用非參數秩和檢驗, 相關性分析采取等級相關分析。用Spearman 等級相關分析法分析人腦膠質瘤組織中Gli-1、Ki-67蛋白表達的相關性，以P＜0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化結果

Gli-1、Ki-67 均高表達于GBM 細胞中。Gli-1 定位于細胞胞質、胞核（見圖1），Ki-67 定位于細胞胞核（見圖2）。

圖1：高級別膠質瘤（A）、低級別膠質瘤（B）、非腫瘤腦組織（C）Gli-1 免疫組織化染色 (×400)圖1：Examples of immunohistochemical staining of Gli-1

圖2：高級別膠質瘤（A）、低級別膠質瘤（B）、非腫瘤腦組織（C）Ki-67 免疫組織化學法染色 (×400)圖2：Examples of immunohistochemical staining of Ki-67

Gli-1 的表達在高級別GBM 中為65.52%（19/29），低級別GBM 中為23.81%（5/21），正常腦組織中為10%（1/10），差異有統計學意義（χ2=12.192，P＜0.01）。（表1）。高級別GBM 與正常腦組織陽性率對比、低級別GBM 與正常腦組織陽性率對比均有統計學意義（P＜0.01）。Ki-67 的表達在高級別膠質瘤中為72.41%（21/29），低級別膠質瘤中為14.28%（3/21），正常腦組織中為10%（1/10），差異有統計學意義（χ2=14.508，P＜0.01）（表2）。

2.2 RT-PCR 結果

GLi-1 mRNA 在高級別膠質瘤、低級別膠質瘤和正常腦組織中的相對表達量分別為0.145±0.020、0.083±0.070、0.060±0.039，P=0.004，差異有統計學意義。其中，高級別膠質瘤與對照組、低級別GBM 與對照組間相對表達量有統計學意義（P＜0.0125）。Ki-67 mRNA 在高級別膠質瘤、低級別膠質瘤和對照組中的相對表達量分別為0.147±0.032、0.113±0.070、0.049±0.035，秩和檢驗結果：χ2=11.30，P＜0.05，有統計學意義。(表3)。

2.3 相關性分析

采用Spearmen 等級相關分析法，在各級別腦膠質瘤中Gli-1的表達與Ki-67 呈正相關（r=0.68，P＜0.05）。

表1：不同級別膠質瘤和正常腦組織對照組Gli-1 IHC 染色結果比較

表2：不同級別膠質瘤和正常腦組織對照組Ki-67 IHC 染色結果比較

表3：ki-67、Gli-1 mRNA 在不同級別膠質瘤及正常腦組織中的相對表達量

3 討論

SHH 信號通路在普遍存在于正常的人體組織中，對于胚胎發育、細胞成熟、細胞分化、內分泌激素的產生有著不可替代的重要作用。近年來，隨著研究的不斷深入，學者們陸續發現SHH 信號通路在腫瘤組織中也有明顯的異常激活現象。

Yuan Z 等研究發現，SHH 信號通路在原發性非小細胞肺癌（NSCLC）中存在廣泛激活的現象，DNA 芯片檢測發現87%腺癌和93%的鱗癌存在GLi-1 的高表達。而在小細胞肺癌（SCLC）中，Gli-1 的表達顯著降低[10-12]。證實Shh 信號通路在NSCLC 中普遍存在，且以鱗癌的臨床意義最為突出。在胰腺癌中，阿布拉等通過RT-PCR 實驗證明Shh、Ptch-1、Smo、Gli-1 在胰腺癌組織中表達量明顯高于胰腺癌旁組織及正常胰腺組織，在表型為CD44+CD24+ESA+的胰腺癌干細胞中, Shh 的表達量比正常的胰腺導管上皮細胞高出46 倍[13-15]。在胃癌中，相關研究表明Shh 的缺失與幽門螺桿菌感染及腸上皮化生有關[5,16-17]。Saze 等對胃癌組織的實驗研究發現，Shh、Ptch-1 的高表達水平與胃癌的預后不良有顯著關系，且Shh 通路中的 Ptch-1 高表達可能與胃癌的進展有關[18]。

Shh 廣泛存在于神經系統、皮膚、胃腸、四肢。在神經系統形成過程中，早期成熟分化的神經細胞分泌Shh，作用于遠處的Gli（+）神經前體細胞，促進其增殖分化為終末細胞。當終末細胞達到一定數量后，負反饋于成熟的神經細胞，Shh 分泌減少，前體細胞的增生減退，通過這種自我反饋的機制來調節個體發育中腦組織的大小和形狀[19,20]。研究顯示在神經信號系統成熟后，Shh-Gli 信號通路處于失活狀態。而異常激活的Shh-Gli 將引起顱內相關腫瘤的發生發展。Jeng 等[21]研究發現阻斷Shh 信號通路可限制膠質瘤細胞的遷移和擴散。Ptch-1 的突變與人髓母細胞瘤的關系也被廣泛證實[22]。何青蘭等[23]用RT-PCR 檢測體外培養的U251 惡性膠質瘤細胞系及人腦膠質瘤組織中Shh 信號通路因子mRNA 的表達，結果顯示在U251 細胞和膠質瘤組織 中的Shh mRNA的表達分別高于其在瘤周組織的表達，提示Shh 的信號通路異常參與了腦膠質瘤的發生發展過程。Shahi 等[24]研究發現Gli-1、Gli-3 mRNA 在大部分星形膠質細胞瘤和髓母細胞瘤組織中呈明顯的高表達。

本實驗以Shh 信號通路中重要的轉錄因子Gli-1 作為研究對象，應用免疫組化的實驗方法發現10 例正常腦組織中Shh、Gli-1 不表達或僅有弱表達，而在50 例膠質瘤組織中29 例檢測到Shh、Gli-1 陽性表達，余下21 例Shh、Gli-1 陰性表達。其中，Shh 在低級別膠質瘤、高級別膠質瘤間對比無統計學意義；Gli-1在高級別膠質瘤中表達量明顯高于低級別。RT-PCR 結果表明：Shh、Gli-1mRNA 的相對表達量明顯高于正常腦組織。但是Shh mRNA、Gli-1 mRNA 在高級別膠質瘤、低級別膠質瘤間對比，無統計學意義。上述結果表明：與正常腦組織對比，在膠質瘤組織中Shh 和Gli-1 在蛋白水平及基因水平均上調，提示Shh 信號通路在GBM 細胞中是普遍激活的。而在不同級別GBM 細胞中Gli-1 在蛋白水平表達量有統計學意義。

Ki67 是一種增殖細胞相關的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關，與細胞增殖活性以及腫瘤的發生、發展和轉移有關，是我國中樞神經系統膠質瘤診斷與治療指南(2015)強烈推薦的生物學標記物(I 級證據)[25]。本研究證實，在GBM 細胞中Gli-1 高表達并與Ki-67 呈正相關，這預示著腫瘤細胞的增殖分化能力與Gli-1 有明顯的正相關性，Gli-1 表達高的GBM 可能預示著更加不良的預后。因此從另一個層面來說適時適當干預Gli-1 的表達，調節Shh 信號通路的激活/失活狀態將有可能作為治療GBM 的一個重要手段。

目前有關Gli-1 及Shh 信號通路在GBM 方面的研究尚少積極探究GBM 發生發展的機制仍然有鎖欠缺，本研究樣本量較少，機制研究深入程度仍需完善，但也為臨床治療GBM 提供了一定指導意義，為后續研究打下部分基礎。