川牛膝醇提物對野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓的影響及機制研究▲

馬秀濤 黃初生 馮 旭 黃子春 葉 超 黃宏劍 陳平偉 劉慧榮

覃家錦1*

(1 廣西醫科大學第一附屬醫院心胸外科，南寧市 530021；2 廣西醫科大學第二附屬醫院心胸外科，南寧市 530000)

肺動脈高壓是由不同病因引起的肺血管病理生理改變，以肺動脈壓力和肺血管阻力進行性升高為主要特征，最終導致右心衰竭的肺循環疾病，其病理變化包括肺血管收縮與重構、肺血管平滑肌和內皮細胞的異常增殖、原位血栓形成等[1]。肺動脈高壓預后較差，死亡率較高，3年生存率<54.9%[2]。肺動脈高壓目前尚無特效治療方法，其確切機制尚未闡明。川牛膝醇提物主要以川牛膝為原料，經過乙醇提取，大孔樹脂分離純化，硅膠柱色譜分離、結晶、干燥得到的生物堿，主要成分為牛膝甾酮等[3]。本研究通過野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓模型，探討川牛膝醇提物對大鼠血流動力學、肺血管的影響及機制。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 川牛膝醇提物由廣西醫科大學第一附屬醫院提供；成年雄性SD大鼠40只，體重(220±20)g，10周齡，由廣西醫科大學實驗動物中心提供；MCT為美國Sigma公司產品；10%的水合氯醛購置于廣西醫科大學第一附屬醫院(批號：1501004-WS10)；光學顯微鏡為日本Olypus電子公司產品；Powerlab多通道生理記錄儀為上海然哲儀器設備有限公司產品。

1.2 方法 將40只SD大鼠隨機均分為對照組、MCT組、高劑量組(川牛膝醇提物24 g/kg)、中劑量組(川牛膝醇提物12 g/kg)和低劑量組(川牛膝醇提物6 g/kg)。后4組大鼠均一次性腹腔注射MCT 60 mg/kg建立肺動脈高壓模型，對照組注射等量生理鹽水。MCT注射第28天，高、中、低劑量組分別給予相應劑量的川牛膝醇提物灌胃，各1次/d，連續2周，對照組和MCT組分別予以等量的生理鹽水灌胃。

1.3 測量指標

1.3.1 mPAP、RVSP和右心室肥厚指數 實驗進行6周后，給予大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰臥固定在操作臺上，游離右頸外靜脈，采用右心導管法[4]，將聚乙烯導管經右頸外靜脈插入大鼠肺動脈，導管另一端接壓力換能器及多通道生理記錄儀，測定平均肺動脈壓(mPAP)及右心室收縮壓(RVSP)。測定完血流動力學指標后處死大鼠，取出雙肺和心臟，去除左右心房和大血管，并沿著室間隔邊緣剪下右心室、左心室及室間隔。去除血液和水分后，利用精密電子天平測量右心室、左心室和室間隔質量。右心室肥厚指數=右心室質量/[左心室質量+室間隔質量]。

1.3.2 肺小動脈中膜厚度 留取右肺上葉于液氮中保存，應用4%多聚甲醛固定，脫水后常規石蠟包埋切片并進行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察肺小動脈的形態學變化。每個樣本隨機選擇直徑25～100 μm的肺小動脈5～10根，在光學顯微鏡下分別測定血管壁內鏡和外徑，其差值為血管壁厚度(WT)，血管壁厚度百分比(%)=(血管外徑-血管內徑)÷血管外徑×100%。

1.3.3 血清MDA含量和SOD活性的檢測 采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)檢測MDA的含量，參照試劑盒說明書操作步驟及計算公式進行操作和計算。采用黃嘌呤氧化酶(XOD)法檢測SOD活性，參照試劑盒說明書操作步驟及計算公式進行操作和計算。

1.3.4 PI3K、Akt mRNA水平檢測 取50～100 mg肺組織置入1.5 mL EP管中，采取Trizol一步法提取RNA。在0.5 mL微量離心管中，加入總RNA 5 μg，補充適量的焦碳酸二乙酯(DEPC)水使總體積達12 μL。在管中加10 μmol/lT重復寡核苷酸(OligodT)引物溶液至15 μL，混勻、離心；70 ℃加熱10 min，立即插入冰浴中，離心，冰上加入10×PCR緩沖液2 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、10 mmol/L dNTPmix 1 μL、0.1 mol/L DTT 2 μL，混勻、離心。42 ℃孵育2～5 min。加入逆轉錄酶Ⅱ1 μL，42 ℃水浴中孵育50 min。于70 ℃加熱15 min以終止反應。將管插入冰中，加入核糖核酸酶H 1 μL，37 ℃孵育20 min，降解殘留的RNA。-20 ℃保存備用。PCR擴增。取0.5 mL PCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA 2 μL；上游引物(10 pmol/L) 2 μL；下游引物(10 pmol/L)2μL；dNTP(2 mM)4 μL；10×PCR緩沖液5 μL；Taq酶(2 u/μL)1 μL。加入適量的雙蒸水(dd H2O)，使總體積達50 μL。輕輕混勻，離心。擴增條件：94 ℃變性30 s；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸24 s，40 個循環。行瓊脂糖凝膠電泳，紫外線燈下觀察結果。采用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描。

1.3.5 PI3K、Akt蛋白水平的檢測 取凍存的肺組織50 mg裂解后提取總蛋白。采用Westem blot檢測PI3K/Akt的表達：蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠電泳；蛋白質從SDS聚丙烯酰胺凝膠轉移至固相支持體；對固定于硝酸纖維素濾膜上的蛋白質進行染色；封閉硝酸纖維濾膜的免疫球蛋白結合位點。

2 結 果

2.1 mPAP、RVSP、右心室肥厚指數及WT百分比比較 與對照組比較，MCT組、低劑量組各指標顯著增高，差異具有統計學意義(P<0.05)。與MCT組比較，高、中劑量組各指標明顯下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。高、中劑量組與對照組比較，各指標間差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組mPAP、RVSP、右心室肥厚指數及WT百分比比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與MCT組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05

2.2 血清MDA和SOD活性比較 與對照組比較，高、中、低劑量組SOD活性明顯高于對照組，MDA含量明顯低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表2(MCT組未測)。

2.3 PI3K、Akt蛋白及其mRNA的表達 與對照組比較，MCT組、低劑量組PI3K、Akt蛋白及其mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)。與MCT組比較，高、中劑量組PI3K、Akt蛋白及其mRNA的表達水平明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比，高、中劑量組PI3K、Akt蛋白及其mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 各組血清SOD和MDA的比較

注：與對照組比較，*P<0.05

表3 各組PI3K、Akt蛋白及其mRNA的表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與MCT組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05

3 討 論

肺動脈高壓是以肺動脈系統循環阻力進行性增加為特征的一組疾病，其病理變化包括肺血管收縮與重構、肺血管平滑肌和內皮細胞的異常增殖、原位血栓的形成等[5-6]，如果不予以治療，會導致右心衰竭，容量負荷增加直至死亡。川牛膝有一定的降壓作用，劉彥灸等[7]發現川牛膝提取物能降低自發性高壓大鼠血壓，其機制可能為其可降低 TGF-β1 對腎小球細胞的刺激，從而減少腎素釋放，降低血管緊張素Ⅱ生成，進而加劇血管擴張，降低血壓。

本實驗采用單次經腹腔注射野百合堿成功建立肺動脈高壓大鼠模型，實驗結果顯示，MCT組大鼠肺動脈高壓、右心室收縮壓、右心室肥厚指數明顯高于對照 組，差異具有統計學意義(P<0.05)。本研究中，高、中劑量組可以明顯降低肺動脈壓力、右心室收縮壓，與MCT組相比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，證實了川牛膝醇提物具有降低野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠肺動脈壓力的作用。在組織層面上，實驗結果顯示，高、中劑量組肺小血管狹窄程度、肺小血管中膜厚度較MCT組有明顯改善，差異具有統計學意義(P<0.05)。川牛膝醇提物可下調肺動脈高壓大鼠PI3K、Akt蛋白及其mRNA表達水平，以高、中劑量組下調最明顯。川牛膝醇提物可以提高大鼠血清超氧化物歧化酶活性，降低大鼠血清丙二醛含量。

肺動脈高壓病因機制十分復雜，目前研究發現包括氧化應激、血管活性物質失衡、內皮功能障礙、遺傳傾向、原位血栓形成和炎癥等[8]。雖然肺動脈高壓的形成機制還沒有完全闡明，但是國內外大量研究證實了氧化應激在肺動脈高壓的病理生理中起到至關重要的作用[9-11]。肺動脈高壓中出現的氧化應激包括蛋白質氧化、脂質過氧化、抗氧化物質含量降低、DNA過氧化和酶類變性[12]。研究發現，活性氧可以作為第二信使，活化信號轉導通路，從而導致細胞功能和結構破壞、組織損傷和器官病變，甚至導致癌變，也參與調節細胞生長途徑、細胞增殖、抑制細胞凋亡、改變轉錄因子[11]。丙二醛是脂質過氧化中的一類終末代謝產物，MDA的含量可以反映出機體內脂質過氧化反應的程度。超氧化物歧化酶是清除體內活性氧簇(ROS)的關鍵酶，也屬于人類機體內天然的抗氧化酶，可以清除體內自由基、參與維持機體內自由基的平衡，從而保護機體組織細胞。活性氧物質及其信號轉導系統參與肺動脈血管內皮細胞重構，其中涉及內皮細胞的損傷和凋亡以及肺動脈血管平滑肌細胞的增殖[13-14]。張志英等[15]研究證實牛膝抗氧化作用非常明顯。本研究發現川牛膝醇提物可以提高肺動脈高壓大鼠血清超氧化物歧化酶活性，降低肺動脈高壓大鼠血清丙二醛含量。川牛膝醇提物具有非常強的抗氧化作用，能夠保護肺小血管內皮功能，阻止脂質過氧化導致的炎癥反應，從而阻止肺動脈高壓的發生。

PI3K/Akt/mTOR信號通路是惡性腫瘤細胞Warburg效應中最重要的調節通路之一[16-17]，Warburg效應的機制為PI3K磷酸化活化Akt，活化后的Akt可以通過mTOR上調HIF1a的表達，后者通過上調糖代謝中關鍵的調節酶3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)表達，從而抑制丙酮酸脫氫酶(PDH)的活性，導致在有氧環境下的葡萄糖代謝轉向糖酵解途徑[18]。PI3K和其相關的信號轉導通路在血管平滑肌細胞的增殖和遷移中發揮著至關重要的作用，機制是通過上調細胞周期蛋白D1(CyclinD1)從而促使血管平滑肌細胞的增殖和遷移。

綜上所述，本研究發現川牛膝醇提物能夠降低野百合堿誘導的大鼠肺動脈壓力，降低肺血管重構，其作用機制可能與下調肺組織PI3K/Akt信號通路有關。