地蜂子中兒茶素含量測定及其醇浸物對軟組織損傷的影響*

梁語嫣， 楊娟， 楊小生， 彭梅

(1．貴州醫科大學 藥學院， 貴州 貴陽 550025； 2．貴州省中國科學院 天然產物化學重點實驗室， 貴州 貴陽 550014)

地蜂子又稱狼牙委陵菜、鐵枕頭，為薔薇科委陵菜屬植物三葉委陵菜和中華三葉委陵菜(potentillafreyniana.)的干燥根莖或全草[1]，分布于湖北、四川、重慶、貴州等地。《全國中草藥匯編》中記載該藥性味苦、澀、微寒[2]，有清熱解毒，鎮痛止癢功效[3]。近年來，對地蜂子的研究集中在化學成分及抗病毒作用，劉梁等[4]對地蜂子中三萜化合物抗病毒作用進行研究，許正剛等[5]測定了地蜂子中的黃酮含量；陳會玲等[6]從地蜂子中分離出兒茶素、β-谷甾醇、胡蘿卜苷等化學成分，兒茶素具有抗菌[7]、抗氧化[8]、預防糖尿病和心血管疾病等作用[9]。地蜂子在土家族、苗族醫藥中應用廣泛，屬常用民間中草藥，但目前作為中藥材尚未被中國藥典(2004年)或地方標準收錄，亦少見對其消腫止痛活性的研究報道。本研究參考其他藥材中兒茶素含量測定的方法，采用高效液相色譜法對貴州白云、龍里、貴定3個地區采集的地蜂子藥材進行含量測定，并觀察地蜂子醇浸物對小鼠軟組織損傷的影響，初步確定其藥效基礎和質量標準，為后期研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

1.1.1材料 地蜂子采于貴州貴陽市白云區、黔南州龍里縣和黔南州貴定縣，經貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定為薔薇科委陵菜屬植物(Potentillafreyniana)。實驗動物系昆明種小鼠，雌雄各半，中國人民解放軍第三軍醫大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK-(軍)2012-0011，體質量(20±2) g。

1.1.2儀器與試劑 XFB-200高速中藥粉碎機(長沙市雨花區中誠制藥機械廠)，N-1200B旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)；SHZ-CD循環水式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)，JA2003電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)，101-2A電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器公司)，SB25-12DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，安捷倫1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)，HY-CM5馬弗爐(鄭州恒亞儀器儀表有限公司)。試劑：兒茶素 (中國食品藥品檢定研究院，批號110877-201604)。三氯甲烷(重慶江川化工集團有限公司)，硅膠板(青島海洋化工有限公司)，乙腈(色譜純，上海星可高純溶劑有限公司)，其他試劑均為分析純，云南白藥氣霧劑(國字標準Z53021107)。

1.2 方法

1.2.1TLC鑒定 (1)供試品、對照品溶液制備：精密稱取地蜂子粉末5.00 g(過2號篩)，加30倍量的甲醇超聲40 min，過濾，取續濾液，作為供試品溶液；另取兒茶素對照品適量，加甲醇制成1 mL含0.5 mg該成分的溶液。(2)鑒定方法：參照薄層色譜法根據2015年版《中國藥典》四部通則0502[10-11]，吸取“1.2.1(1)”項供試品、對照品溶液各5 μL，點于普通型GF254硅膠薄層板上，以三氯甲烷∶丙酮∶甲醇(15∶7.5∶2.2)為展開劑展開，取出，晾干，噴以5%硫酸溶液，在110 ℃加熱至斑點顯色清晰。

1.2.2兒茶素的含量測定 (1)供試品溶液的制備：精密稱定藥材樣品粉末5.00 g，加入50 mL甲醇，超聲40 min，過濾，精密補足，定容50 mL，即得；以甲醇溶液作空白對照。(2)對照品溶液制備：精密稱取兒茶素對照品0.86 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，配制為對照品溶液，即得。(3)色譜條件[12-13]：Gemini-Nx色譜柱(5 μm，250 mm × 4.6 mm)，以0.1%磷酸溶液∶乙腈(85∶15)為流動相，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長280 nm，進樣量10 μL，理論塔板數按兒茶素計不低于3 000。(4)專屬性考察：分別精密吸取上述“1.2.2(1)、1.2.2(2)”項供試品、對照品和空白對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，照“1.2.2(3)”的色譜條件測定，記錄色譜圖。(5)線性關系考察：按“1.2.2(3)”的色譜條件，精密吸取兒茶素對照品溶液2、4、6、8、10 μL進樣，測定峰面積，以進樣濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，用繪圖軟件(Origin 7.5) 繪制工作曲線獲得線性濃度范圍及相關系數(r)。(6)方法學考察：精密度的實驗，按“1.2.2(3)”項的色譜條件，吸取同一供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，重復進樣6次，計算兒茶素的峰面積RSD為0.24%，表明該儀器精密度良好；穩定性試驗，按“1.2.2(3)”的色譜條件，分別0、2、4、8及12 h吸取同一供試品溶液10 μL進樣，測得5份供試品溶液中的兒茶素平均含量為0.21%，RSD均值為1.2%，表明供試品溶液在12 h內穩定；重復性試驗，精密稱取與上述實驗同一批地蜂子藥材粉末5份，按“1.2.2(1)”項下方法制備供試品溶液，分別按“1.2.2(3)”的色譜條件測定峰面積，平行測定6份樣品兒茶素平均含量為0.2%，RSD均值為0.11%，表明重復性穩定；加樣回收試驗，按“1.2.2(1)”項方法制備供試品溶液，精密稱取兒茶素含有量已知的干燥藥材粉末6份，每份約0.5 g，精密加入對照品溶液(0.86 g/L)1 mL，按“1.2.2(3)”的色譜條件，進樣測定并計算加樣回收率。(7)樣品含量測定：精密稱取3個產地樣品粉末約5 g，共3份，按“1.2.2(1)”項方法制備供試品溶液，在“1.2.2(3)”的色譜條件下測定，計算含量。

1.2.3地蜂子醇浸物對小鼠軟組織損傷影響 (1)試藥制備：取與上述實驗同一批地蜂子藥材粉碎過10目篩，稱取10 g于廣口瓶內，加入濃度80%食用級乙醇50 mL，超聲30 min后浸泡7 d，過濾，取25 mL濾液用純凈水定容至50 mL，備用。(2)造模：取體質量(20±2)g昆明種小鼠30只，雌、雄各半；于實驗前1天以5%的硫化鈉后肢脫毛，將小鼠固定在自制解剖板上，過與50 g砝碼直徑相當的3 cm塑料管，用50 g重的砝碼自管中15 cm處垂直自由落體沖擊小鼠左后大腿外側肌肉豐厚處，連續打擊30下，造成局部軟組織損傷瘀腫模型[14]。(3)分組： 造模后，將動物隨機分成空白組、陽性對照組、地蜂子組，每組10只；空白組于患處涂抹生理鹽水，陽性對照組涂抹云南白藥噴霧劑，地蜂子組涂抹上述“1.2.3(1)”制備液；每天早中晚定時給藥，每天3次，連續給藥3 d。

1.3 觀察指標

損傷癥候指數，參照文獻[15-16]在治療第1、3 天，觀察小鼠局部軟組織損傷癥候情況，對瘀斑顏色、皮下淤血與腫脹程度3個項目評分、每個項目分為3等級；瘀斑紫暗色計1分、紅色計0.5分、色澤正常計0分；皮下瘀血多且呈塊狀計1分、少量點狀計0.5分、無瘀血者計0分；腫脹程度，皮膚明顯腫脹計1分、皮膚稍有腫脹計0.5分、同正常組織計0分；將3個項目的分值合計并進行統計。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 TLC鑒別

在日光下，地蜂子供試品色譜中均檢出和對照品色譜相對應的橙色斑點A，提示分離效果與重復性良好，見圖1。

注:1為兒茶素對照品，2～3為地蜂子供試品，4為地蜂子對照藥材圖1 地蜂子TLC色譜結果Fig.1 TLC chromatogram of Potentilla freyniana

2.2 含量測定方法考察及樣品測定

2.2.1專屬性考察結果 供試品溶液色譜圖與兒茶素對照品溶液色譜圖在相同保留時間具有吸收峰，空白對照液在相同時間無吸收峰，提示本方法無陰性干擾。結果見圖2。

2.2.3方法學考察 兒茶素含量的平均回收率為100.13%，RSD值為2.18%，提示該方法準確度良好，見表1。

2.2.4樣品含量測定 3個產地樣品以藥材干燥品計算，其中兒茶素平均含量分別為白云樣品0.17%、龍里樣品0.16%、貴定樣品0.20%。

表1 地蜂子中兒茶素成分加樣回收率實驗結果Tab.1 The recovery rate of catechin

2.3 急性軟組織損傷模型小鼠的治療效果

造模后，空白組、陽性對照組、地蜂子組小鼠很快出現傷肢皮下瘀血、肌肉腫脹及肌肉顏色加深，治療第1天各組間小鼠的損傷癥候指數比較差異無統計學意義(P>0.05)。第3天給藥后，空白組損傷部位肌肉腫脹明顯，有塊狀淤青；陽性對照組基本完全恢復；地蜂子組損傷部位肌肉顏色淺紅色，無紅腫，有少量淤青。地蜂子組、陽性對照組小鼠損傷癥候指數均較空白對照組顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見圖3及表2。

圖2 空白對照品、兒茶素對照品和供試品溶液HPLC色譜結果Fig.2 HPLC chromatograms of blank control, catechin standard and Potentilla freyniana sample

圖3 各組小鼠不同治療時間軟組織損傷恢復情況Fig.3 Recovery of soft tissue injury in different treatment groups

表2 各組小鼠不同治療時間損傷癥候指數的比較Tab.2 Comparison of injury symptom index of different treatment time in each group

與空白組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01

3 討論

中藥化學成分多且復雜，對其進行分離鑒定的方法很多，其中薄層色譜法因其便捷、快速及微量的特點，是應用最為廣泛的方法。薄層色譜鑒別研究考察了乙醇、甲醇兩種提取溶劑，考察了30、40、50 min超聲提取時間；考察了三氯甲烷∶丙酮∶甲醇(15∶7.5∶2.2)、甲苯∶丙酮∶甲酸(4.0∶3.0∶2.0)、氯仿∶甲醇∶甲酸(5∶3∶2)3種展開系統；考察了根皮苷、胡蘿卜素、兒茶素[17]3個對照品。結果顯示，以甲醇為提取溶劑，超聲時間為40 min，三氯甲烷∶丙酮∶甲醇(15∶7.5∶2.2)作為展開劑，選擇有紫外吸收，斑點清晰的兒茶素為對照品，對地蜂子提取物進行薄層色譜檢識效果最佳。

通過參考文獻[18]以及通過二極管陣列檢測器200～800 nm全波長掃描，確定兒茶素最大吸收波長為280 nm，作為本研究的檢測波長。進行預實驗時采用乙腈∶水(50∶50)作為流動相，發現兒茶素峰與相鄰峰無法分離，將流動相改為0.1%磷酸溶液∶乙腈(85∶15)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min時，兒茶素峰出峰快，且與相鄰峰分離良好。這可能是因酸性條件下抑制了兒茶素中多羥基結構的解離，從而改善了分離度[19]。本實驗3個產地的地蜂子藥材中兒茶素含量相近，可能的原因是3個產地所在的地區距離近，光照、濕度、土壤結構差異不大。

軟組織損傷是指全身肌肉、韌帶和肌腱的損傷，疼痛、腫脹、瘀傷和功能喪失如垂掛為其主要臨床表現，是生活和運動中的常見疾病[20-21]。地蜂子作為一種民間草藥，其鎮痛、抗病毒和提升免疫作用確切[22-23]。為了模擬人體軟組織損傷時組織破裂或細胞破損等病理變化，實驗動物造模尤為重要，因為不同的造模方式造成的損傷程度和持續時間不同，結果也不同。目前軟組織損傷模型有砝碼法、注射法、壓迫法、撞擊法等[24]，本研究采用砝碼法復制急性軟組織損傷，是因與其他方法相比，該法操作簡單，不需要借助特定的儀器，有良好的重復性，但研究時必須保持打擊的高度和重量一致，才能保證等同條件下造成軟組織損傷的強度一致。本研究采用小鼠作為軟組織損傷實驗對象，較為經濟實用，在造模過程中也容易控制。目前對地蜂子的體外研究中，均采取灌胃的給藥方式，暫無外用報道。因此，本研究遵循民間外敷用法。軟組織損傷實驗中，各組不同治療時間損傷癥候指數的比較可以看出，與空白組相比，地蜂子組可以降低損傷癥候指數(P<0.05)，提示地蜂子醇浸物對小鼠的淤青及紅腫有治療效果，初步分析該藥材有活血化瘀及消腫的活性，從而為地蜂子的進一步開發利用提供依據。

綜上所述，本研究建立的HPLC測定方法簡單、準確，可用于地蜂子中兒茶素含量的測定；地蜂子醇浸物對小鼠軟組織損傷具有改善作用。