三種淀粉樣前體蛋白胞外結構域突變體的建立及功能驗證*

張鵬， 崔冬冰， 舒莉萍**， 范安然**

(1.貴州醫科大學 細胞工程生物醫藥技術國家地方聯合工程實驗室, 組織工程與干細胞實驗中心， 貴州省再生醫學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004; 2.中國醫學科學院 成體干細胞轉化研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

阿爾茨海默綜合征(alzheimer's disease,AD)是最常見的一種神經退行性疾病，也是癡呆癥的最常見類型，全球范圍內每7 s就有一個AD新病人產生[1]。盡管AD的病原學以及病理學傳播機制仍存在很大爭議，但是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)及其加工被認為在AD的發病機制中起著重要作用[2]。APP是一種I型跨膜蛋白，是AD病人大腦中淀粉樣斑塊中的β-淀粉肽的來源[3]，但對APP的各個結構域的空間結構、以及各個結構域怎樣通過與其他分子相互作用發揮功能仍不清楚[4]。APP的胞外結構域，特別是可以與多種胞外蛋白相互作用的E1和E2結構域 (extracellular domain 1,extracellular domain 2)，可能是APP激活信號通路及發揮生理學功能的重要原因[5]。因此，為研究APP胞外結構域的功能，本研究建立了3種表達APP胞外結構域突變體的細胞株及表達野生型APP的細胞株，并對這幾種細胞株是否可以作為APP結構域功能研究的有利模型進行篩選，報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM基礎培養基、細胞培養用血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰消化酶、100×非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇及100 000 U/L青鏈霉素均來自Gibco公司，FuGENE 6質粒轉染試劑購自Roche公司，6E10抗體、G418及β-巰基乙醇購自Sigma公司，羊抗鼠IgG來自北京索萊寶科技有限公司，24孔板、T25培養瓶及T75培養瓶購自Corning公司，質粒小提試劑盒購自天根公司；2× hot start PCR 預混液購自TAKARA公司，T4連接酶、內切酶SgfI及MluI購于NEB公司，pCMV-APP695質粒購自Addgene，CHO細胞為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1CHO細胞培養 CHO細胞系培養于T75的細胞培養瓶，并使用DMEM完全培養基進行培養，完全培養基組成包括10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、10 mmol/L β-巰基乙醇、1%谷氨酰胺及1%青鏈霉素；每天觀察細胞生長狀態， 3 d換1次液，細胞生長融合度至90%時進行傳代培養。

1.2.2APP突變體片段擴增 (1)使用Touchdown PCR的方法進行APP突變體片段的擴增，25 μL反應體系： APP695質粒2 μL、PCR mix 12.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，最后用無RNA酶水補足體積到25 μL。Touchdown PCR包括2個階段：階段1為降落階段，以比引物Tm值高10 ℃的溫度作為起始退火溫度進行PCR擴增，然后每經過一個循環退火溫度降低1 ℃，直到退火溫度降到比Tm值低5 ℃為止，共進行15個循環；階段2為普通擴增階段，在此階段中，使用第1個階段中所確定的最終退火溫度進行擴增。(2)使用融合PCR構建E2結構域突變體，融合PCR是將多個基因片段連接起來的PCR方法，主要包括3個階段：第1個階段為常規PCR階段，主要擴增E2上游和下游基因，反應條件和反應體系同Touchdown PCR；第2階段為融合階段，25 μL反應體系為上游片段 2 μL、下游片段 2 μL、PCR mix 12.5 μL、最后用無RNA酶水補足體積到25 μL，反應條件為95 ℃預變性5 min，94 ℃變性20 s、57 ℃退火20 s、72 ℃延伸40 s、進行10個循環，72 ℃延伸5 min；第3階段是融合后擴增階段，取第2階段的反應管加入上下游特異性引物，進行15個循環。最后瓊脂糖電泳進行驗證。

1.2.3APP突變體蛋白表達檢測 使用Western blot的方法鑒定穩定轉染細胞系中APP突變體的表達，步驟為：配制10%分離膠10 mL，并用70%的酒精進行液封，分離膠凝好后配制4 mL濃縮膠。細胞裂解液以及上清的上樣體積為20 μL，將其分別于2×上樣緩沖液混勻后，置于100 ℃水浴煮10 min即可上樣。指示帶泳至膠底部后停止電泳，4 ℃轉膜過夜。轉膜完成后，取出PVDF膜，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應一抗4 ℃過夜。次日取出PVDF膜用純水漂洗3次，10 min/次。然后加入二抗窒溫孵育1 h，純水漂洗3次，10 min/次。用ECL液室溫避光孵育，暗室顯影。

1.2.4細胞轉染 在CHO細胞生長融合度為90%時進行傳代。使用細胞計數板按照1×105密度接種于24孔板中，培養24 h后換成新鮮培養液；分別將Opti-MEM 50 μL與Fugen HD 3 μL試劑混合，將APP突變體質粒1 μg與Opti-MEM 50 μL混合，然后將稀釋后的質粒與稀釋后的Fugen HD試劑混合后室溫孵育15 min，最后加入24孔板，每孔50 μL，轉染6 h后，換成新鮮培養液。

1.2.5穩定轉染細胞系的篩選 在CHO細胞轉染APP突變體質粒后24 h，換成篩選培養基，篩選培養基組成為完全培養基加1 g/L的G418，每天觀察細胞生長狀態，以未轉染的CHO細胞作為對照。第7 天對照組細胞基本全部死亡，實驗組部分細胞繼續存活；在存活細胞融合度至90%時，胰酶消化細胞，稀釋至10 000個/L，然后以100 μL/孔接種于96孔板，細胞貼壁后，在顯微鏡下篩選只含1個細胞的孔，并做標記，標記孔內即為單克隆細胞系。細胞融合度至90%時進行傳代擴大培養，此后降低G418濃度為400 mg/L維持轉基因的表達。

2 結果

2.1 APP蛋白E1結構域突變體細胞株的建立

通過Touch down PCR方法，將APP基因中編碼E1結構域(extracellular domain 1)的59～608 bp片段進行擴增，獲得了長度為1 502 bp的編碼片段(圖1A中的1～5泳道)。將E1結構域突變后的片段與pCMV6載體進行重組，使用SgfI和MluI雙酶切驗證，結果表明重組質粒中切出大小為1 502 bp的片段(圖1B泳道1～2，泳道3～4為未酶切質粒)，證明載體進行了正確重組。最后通過G418抗性篩選出表達E1結構域突變體的單克隆細胞株并驗證其表達和分泌。細胞總蛋白在75 kDa附近有雜交條帶，且與預測分子量一致，證明了重組載體可以正常表達(圖1C泳道1～8)。細胞培養上清液中也有與預測分子量一致的條帶，證明了其可以正常分泌(圖1D泳道1、3～7)。

圖1 APP蛋白E1結構域突變體細胞株的建立Fig.1 The effect of ED1 deletion on APP expression and secretion

2.2 APP蛋白E2結構域突變體細胞株的建立

通過常規PCR的方法，獲得了APP基因中位于E2結構域上游的基因片段，長度為873 bp；同時獲得位于E2結構域下游的基因片段，長度為582 bp(圖2A)，然后通過融合PCR的方法將上下游片段連接，獲得了長度約為1 500 bp的E2結構域編碼序列缺失的APP片段(圖2B)。使用E2結構域突變的片段與pCMV6載體構建重組載體，通過SgfI和MluI雙酶切獲得5 000 bp和1 500 bp目的片段，證實了載體的正確重組(圖2C)。通過G418抗性篩選出單克隆細胞株，使用Western blot檢測細胞內和細胞培養液中dE1突變體蛋白表達，結果證實dE1突變體不僅在細胞內表達(圖2D)，并且可以正常分泌到胞外空間(圖2E)。

圖2 APP蛋白E2結構域突變體細胞株的建立Fig.2 The effect of ED2 deletion on APP expression and secretion

2.3 信號肽在調控胞外結構域的釋放

為了研究信號肽(signal peptide，SP)在APP分泌中的作用，本研究將載體通過SgfI和MluI進行雙酶切，去除了大小約為3 000 bp 的APP 全長片段(如圖3A泳道1)，然后與PCR獲得了信號肽缺失的dE1-APP片段(圖3A泳道2)連接后獲得了信號肽缺失的dE1-APP重組載體(dE1-APPΔSP，圖3B)。Western blot結果顯示信號肽缺失后，APP雖然可以在細胞內表達(圖3C)，但是不能正常分泌到細胞外空間(圖3D)。

圖3 APP蛋白信號肽缺失和E1結構域突變體細胞株的建立Fig.3 The effect of ED1 & SP deletion on APP expression and secretion

3 討論

AD的主要病理學特點是大腦中形成淀粉樣斑塊和神經纖維結節，其中淀粉樣斑塊是由于APP切割產物Aβ在細胞外積累形成的，而神經纖維結是由于磷酸化的微管蛋白(Tau)沉積形成[6-7]。盡管AD的病原學以及病理學傳播機制仍存在很大爭議，但是由于APP或者其酶切產物可以導致Tau蛋白磷酸化、突觸功能異常、神經元死亡等現象[8-9]，據此形成了APP處于AD疾病形成的中心位置的假說。所以對APP功能的研究對于揭示AD的發病機制的理解具有重要意義。因此，本研究建立起3種APP的突變體，并希望通過觀察3種APP的突變體對APP蛋白的胞外分泌有無影響，探索APP結構跟功能之間的關系。

APP被α-分泌酶切割后，氨基端會釋放形成可溶性的胞外結構域片段(sAPPα)和由83個氨基酸組成的羧基端(C83會繼續固定在細胞膜上)。停留在細胞膜上的C83會被γ分泌酶繼續切割形成P3肽段和APP胞內結構域片段(APP intracellular domain，AICD)，這個過程被稱為APP的非淀粉樣形成過程[10-11]。與此類似，APP還可以被β-分泌酶切割形成可溶性的胞外結構域片段(sAPPβ)以及與細胞膜結合的99個氨基酸組成的C99片段，C99片段可以被γ分泌酶繼續切割形成具有神經毒性的Aβ片段以及AICD[12]。APP的這種多位點切割以及代謝產物的多樣性使APP可以發揮多種生理學功能，但是也使APP的功能確定產生困難[13]。因此合適的APP功能的體外研究模型對于確定APP的正常生理功能和在AD病理學中的功能至關重要，本研究建立的幾種細胞模型，都可以正常表達APP及其突變體蛋白，并且不會影響它們的正常分泌，因此可以廣泛以用于APP功能的確定。

APP的功能與其結構密切相關，在過去的研究中對于APP結構以及對應結構域的具體生物學功能進行了大量研究。APP胞外結構域主要是由E1和E2兩個結構域以及插入在兩者之間的Kunitz結構域(KPI)以及酸性結構域(AcD)組成[14]。E1結構域中含有肝素結合亞結構域(heparan binding subdomain， HBD)，HBD具有正電荷表面，能夠和帶有負電荷的分子結，HBD結構域與生長因子及其受體類似蛋白的結合位點相似[15]。HBD區域可以與APP或者淀粉樣前體蛋白類似蛋白(APLP之間通過二硫鍵形成同源二聚體或異源二聚體，從而增加APP在細胞表面的穩定性[16-17]。此外，有研究發現APP的E1結構域可以作為類生長因子促進神經節的生長[15]；Beher等[18]發現E1區域還可以與膠原蛋白I結合。E1結構域還可以作為肝素的結合位點，在APP形成二聚體的過程中發揮重要作用[19]。在E2結構域的近膜端還含有第2個HBD，其對于硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)具有低親和力的結合能力[20]。E2與HSPG的結合可以增加APP與其低親和性受體的結合能力[21-22]。Dahms等[23]通過結晶學手段發現E2結構域可以作為Cd2+的結合位點，與Cd2+結合后，可以增加E2結構域的穩定性。Mayer等[24]的另一項研究發現E2結構域可以通過與金屬離子的結合調節APP寡聚物的形成。E2結構域也可以做作為硫化肝素的結合位點，通過與硫化肝素結合后增加APP的親和性，從而有利于APP與其它輔因子結合[20]。盡管如此，APP的胞外結構域E1和E2的生理學作用仍有待于進一步研究，與E1和E2結構域相互作用的大量分子也有待于進一步擴充，并且不同的互作分子與E1和E2結構域結合后在AD中發揮什么作用，這些問題對于理解AD的疾病進程十分重要。本研究建立的E1和E2結構域突變體細胞株可以作為確定E1和E2結構域生物學功能、發現其互作蛋白的有效模型，在解決上述問題中起到關鍵作用。

APP的定位和胞內轉運對于APP的加工和處理十分重要，特定基序缺失的APP，其Aβ的產生會減少[11]。APP蛋白序列中的YENPTY基序對于APP內吞和加工發揮重要作用[25]。在APP蛋白中，其1～18號氨基酸是SP序列，APP的信號肽其作用是在編碼APP的基因翻譯后，將APP前體蛋白導向到內質網中，APP進入內質網后會產生蛋白折疊、磷酸化和糖基化等，同時也是其進入細胞膜轉運系統的關鍵步驟。本研究發現缺失信號肽后，盡管APP可以在細胞內表達，但是其向細胞外的分泌會受到影響。

綜上所述，本研究成功構建了3種淀粉樣前體蛋白胞外結構域突變體細胞株，并且通過Western blot驗證了不同細胞株中APP蛋白的表達及分泌。構建的細胞株可在APP正常生理學功能和在AD病理學功能的研究中發揮重要作用。