Alexa Fluor 488 NHS Ester染料提高流式細胞周期檢測結果的可行性*

張鵬， 彭濤， 范安然， 蘭金芝， 何志旭， 舒莉萍**， 周艷華**

(1.貴州醫科大學 細胞工程生物醫藥技術國家地方聯合工程實驗室, 組織工程與干細胞實驗中心，貴州省再生醫學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004; 2.中國醫學科學院 成體干細胞轉化研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550004; 3.遵義醫科大學附屬醫院 兒科學教研室， 貴州 遵義 563000)

根據細胞內DNA合成的時間不同，真核細胞周期的間期分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)[1]，S時期DNA含量處于G1時期和G2時期之間[2]。在正常細胞中，細胞周期的控制受到大量基因的調控[3]，這些基因表達的動態平衡對于細胞增殖及生長抑制具有重要作用，如果這種動態平衡被打破，細胞往往會發生損傷，從而進一步發生凋亡[4]。有研究發現，腫瘤細胞內突變基因會使細胞周期發生變化，最終導致細胞增殖的異常[5-6]；在神經退行性疾病中也伴隨著細胞周期的異常[7]，因此細胞周期的檢測對于神經退行性疾病的診斷及發病機制的研究具有重要的作用。在目前眾多的細胞周期檢測方法中[8-9]，流式細胞術是基于細胞內DNA含量的細胞周期檢測的最常用方法[9-10]。碘化丙啶(propidium iodide，PI)作為一種核酸物質的染料在流式檢測細胞周期的檢測中比較常用[11]，PI與DNA結合，經488 nm激發光激發后發出630 nm的熒光，熒光強度與DNA的含量成正比[12-13]。但在實際實驗中，常常因為細胞密度及實驗操作的不同會導致染色結果的不穩定，從而造成細胞周期檢測結果不可靠[14]。Alexa Fluor 488 NHS Ester染料含有N-羥基琥珀亞胺(N-Hydroxysuccinimide)活化基團， Alexa Fluor 488熒光基團，能直接與生物分子上的氨基(-NH2)反應形成穩定的酰胺鍵，可用于標記任何含伯胺的生物分子[5]，被標記細胞的熒光強度與染料濃度在一定范圍內呈線性關系[15-16]。為解決流式細胞檢測中引起結果不穩定的細胞密度及實驗操作的問題，本研究使用不同濃度的Alexa Fluor 488 NHS Ester染料處理不同實驗組細胞，將不同組細胞進行“標記”后混合在一起進行常規流式細胞檢測，對檢測結果進行分析，發現采用不同濃度Alexa Fluor 488 NHS Ester染料預染細胞后混合在一起進行PI染色，能夠提高細胞周期檢測結果的可信性，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

細胞周期檢測采用BD Pharmingen細胞周期與凋亡檢測試劑盒(550825)，流式細胞儀為貝克曼FC500型，血清為Biological Industries公司胎牛血清，Alexa Fluor 488 NHS Ester染料購自Thermo Fisher公司；293細胞為實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1細胞處理 293細胞采用添加10% FBS的DMEM于4×3的12孔板中培養，每行4個孔分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ組，每列3個孔為重復孔。細胞傳代培養48 h后消化收取細胞于離心管中，離心去上清液后采用預冷的70%乙醇溶液固定細胞；Alexa Fluor 488 NHS Ester染料用甲醇溶解，配制成濃度為50 mg/L的儲存液，使用時用PBS將其稀釋成待用濃度。

1.2.2細胞染色 取乙醇固定細胞，每組分為兩份，一份按照細胞周期檢測試劑盒說明進行染色(方案一)；另一份先將各組細胞分別用0.0、0.4、2.0及10.0 mg/L的Alexa Fluor 488 NHS Ester染料室溫染色15 min，離心洗滌兩次去除染色液，然后將各組細胞混合于一支試管中，再使用細胞周期檢測試劑盒進行染色(方案二)。

1.2.3上機檢測與數據分析 按照方案一染色的細胞，每組細胞經細胞周期檢測試劑盒染色15 min后，用200目篩過濾至流式上樣管中分別上機檢測，每個樣品獲得的檢測結果采用Flowjo X流式數據分析軟件單獨分析。方案二染色的細胞，4組細胞混合于一支試管中，1次上樣，獲得的數據同樣采用Flowjo X流式數據分析軟件進行分析。

2 結果

2.1 方案一的細胞周期

由圖1可見，在采用常規細胞周期檢測方法染色時，方案一Ⅲ組第一次檢測結果(圖1 方案一Ⅲ組A)與其他組(Ⅰ，Ⅱ和Ⅳ)不一致，Ⅲ組A的熒光信號在坐標軸上偏左(圖中黑色箭頭所指)。分析原因發現，與其他各組相比，在采用低速上樣的時候，方案一Ⅲ組A的上樣速度超過400個/s，而其他各組上樣速度處于200個/s左右(表1所示)，說明方案一Ⅲ組A試管中細胞密度明顯高于其他各組，最終導致染料相對不足，致使細胞染色不充分。為了驗證染料不足的原因，試驗過程中向Ⅲ組A的試管中補加了一倍的PI染液(標記為方案一Ⅲ組B)，染色15 min后重新上機檢測，檢測結果如圖中方案一Ⅲ組B所示，熒光信號值恢復至與其他各組一致的水平(圖中灰色箭頭所指)。

注：黑色箭頭所指為Ⅲ組A 的熒光信號在坐標軸上偏左，灰色箭頭為Ⅲ組B熒光信號值恢復至與其他各組一致的水平圖1 方案一獲得的各組細胞周期檢測結果Fig.1 The result of cell cycle detection using traditional method

表1 方案一各組細胞在流式細胞儀上樣時每秒檢測到的細胞數(個/s)Tab.1 Cell number per second in flow cytometry analysis using traditional method

2.2 不同濃度Alexa Fluor 488 NHS Ester染色后細胞分群

如圖2所示，經過0.0、0.4、2.0及10.0 mg/L Alexa Fluor 488 NHS Ester染色后，4組細胞混合在一起上樣，經Flowjo X流式分析軟件分析，可見細胞在FL1通道明顯分為4群。表明采用上述濃度的Alexa Fluor 488 NHS Ester染料能將不同組的細胞貼上不同的“標簽”。

2.3 方案二的細胞周期

不同濃度Alexa Fluor 488 NHS Ester染色后，將4組細胞混合成一管，使用PI對細胞進行染色，然后使用流式細胞檢測儀檢測Alexa Fluor 488 NHS Ester染料和PI的信號(圖3A)。通過Alexa Fluor 488 NHS Ester信號可以將細胞分為4組(圖3B)，通過PI信號對4群細胞分別進行細胞周期分析，與圖1比較其結果一致性更好，不同組熒光信號分布相似(圖3C所示)。

注：A為散點圖，B為細胞在525 nm通道的分群情況，C為細胞在525 nm+SSC通道分群情況圖2 不同濃度Alexa Fluor 488 NHS Ester染料后細胞細胞分群結果Fig.2 Cell population after staining with defferent amount of Alexa Fluor 488 NHS Ester

圖3 改進后的流式細胞周期檢測結果Fig.3 The result of cell cycle detection using "improved" flow cytometry method

3 討論

阿滋海默癥(alzheimer disease，AD)等神經退行性疾病中往往伴隨著細胞周期的異常[6]。因此尋找優化的方法檢測細胞周期對于神經退行性疾病的研究就有非常重要的作用。在采用流式細胞儀檢測細胞周期的研究中，多數學者會根據細胞周期檢測試劑盒的推薦方案進行染色[17]。不同試劑公司的試劑盒染色方案有所不同[18]。很少有學者關注染色方案的差異對實驗結果的影響。多數學者熟悉染色步驟后，即使購買的是不同品牌的試劑，習慣性的按照所熟悉的步驟進行染色，但是檢測結果往往存在不可重復性[19]。其次，在進行藥物抑制實驗的過程中，隨著藥物濃度的增加，細胞增殖逐漸被抑制，細胞密度逐漸降低[20]。相比較而言，對照組的細胞增殖較快，密度較大。但實際操作中，很少有研究者在染色前將各組的細胞密度調整至相同數量再進行染色[21]。本研究中，方案一Ⅲ-A組的細胞信號峰值偏小，可能是因為該組細胞密度較高，染料相對不足，致使細胞染色不充分，熒光信號相對偏弱造成；流式細胞儀的上樣速度也顯示出方案一Ⅲ組-A的上樣速度最大，表明該組細胞密度較大。通過補加染料后，細胞信號峰的位置恢復正常，細胞上樣速度也與其他分組的上樣速度接近了。再者，經70%乙醇固定后的細胞要經過3次離心洗滌，去除乙醇，然后再進行染色，在洗滌過程中極易造成細胞丟失[22]。所以最終各處理組的細胞密度不盡相同，因此導致加入染色液一致的情況下各組細胞的著色不一致，造成上機檢測時信號強度出現差異[23]。本實驗研究Alexa Fluor 488 NHS Ester染料在細胞周期檢測中使用的可行性。結果發現在常規流式細胞檢測之前，通過不同濃度的該染料對各組細胞進行染色，給各組細胞貼上一個“標簽”，而后將細胞外未著色的染料洗滌去除后，將各組細胞混合于一組中進行PI染色。此方法可保證組內所有細胞所處的處理方式以及檢測條件的一致性。實驗結果表明，經過貼“標簽”的細胞，在數據分析時，“標簽”可以輕易的將各組細胞區分開。通過對各“標簽”組細胞進行細胞周期檢測結果分析發現，所得的周期檢測結果一致性更高。

綜上所述，采用不同濃度Alexa Fluor 488 NHS Ester染料預染細胞后混合在一起進行PI染色能夠提高細胞周期檢測結果的可信性，在神經退行性疾病研究中可節約病人的取樣次數及數量。