甲基結合蛋白1對小鼠胚胎干細胞增殖及克隆形態的影響*

張鵬， 楊紅蘭， 劉含， 周艷華， 楊燕， 范安然， 何志旭， 舒莉萍**

(1.貴州醫科大學 細胞工程生物醫藥技術國家地方聯合工程實驗室, 組織工程與干細胞實驗中心， 貴州省再生醫學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.中國醫學科學院 成體干細胞轉化研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 3.遵義醫科大學附屬醫院 兒科學教研室， 貴州 遵義 563000)

全能性干細胞是一類處于未分化狀態、可以長期自我更新和自我分化、具有在一定條件下分化形成各種組織細胞潛能的細胞[1]，在體外獲得足夠數量的全能干細胞對于再生醫學的發展至關重要。隨著體外誘導多能干細胞以及體外多能干細胞分化技術的發展，體外獲得組織特異性及疾病特異性的細胞已經成為現實，但是其過程還需要進一步的優化，其分化的相關機制還需進一步的闡明。干細胞分化及誘導多能性干細胞獲得過程中伴隨著全基因組轉錄水平及染色質結構的變化，而這些變化會受細胞內的表觀修飾及其識別蛋白的影響[1-6]。因此，研究DNA表觀修飾及其與甲基結合蛋白(methyl-CpG binding domain，Mbd)的相互關系對闡明干細胞分化以及重編程的機制至關重要。Mbd2和Mbd3在胚胎干細胞分化以及重編程過程中具有非常重要的作用[7-10]，提示同家族蛋白Mbd1可能在多能性獲得和喪失過程中也具有非常重要的作用。神經退行性疾病危害人類的健康，如何修復損傷的神經細胞對于治療神行退行性疾病至關重要。有研究發現，多能性胚胎干細胞在體外可以分化為神經干細胞，這為神經退行性疾病的治療提供了新的思路[2-3]。有研究發現Mbd1在神經干細胞多能性的維持過程中具有非常重要的作用[11]。Mbd1敲除的神經干細胞分化潛力下降，其分化為β-tubulin陽性的神經細胞能力下降[12]。這一結果暗示在神經前體細胞獲得多能性的過程中Mbd1可能起到非常重要的作用。本研究通過研究Mbd1在胚胎干細胞多能性維持過程中的功能，為神經退行性疾病的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗中所用的化學試劑除非特殊指明，都來源于Sigma公司；小鼠胚胎干細胞(J1)制備參考文獻[13]，用于gRNA和Cas9表達的質粒px459來源于Addgene，寡聚核苷酸合成于ITD公司，Mbd1抗體購買于Abcam公司，HRP標記二抗和ECL液體購買于Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1gRNA設計及克隆 根據Crispr/Cas9的工作原理，使用gRNA在線設計軟件(https://benchling.com/enterprise/crispr)針對Mbd1基因轉錄起始位點設計gRNA，然后在正義鏈5′端添加CACC，反義鏈5′端添加AAAC。序列分別為gRNA oligo 上游引物為5′-CACCGTTCTGTCCCTGAAGCATCTA，gRNA oligo 下游引物為5′-AAACTAGATGCTTCAGGGACAGAAC。合成的正義鏈和反義鏈DNA在1× NEBuffer2.0中退火后與BbsI限制性內切酶酶切后的骨架載體使用T4-DNA連接酶連接，然后將連接產物轉化到JM109感受態細胞中，并在含有氨芐抗性的平板過夜生長。挑取單個克隆在含有氨芐抗性的培養液中培養，收集細胞提取質粒并進行測序驗證gRNA序列是否克隆成功。

1.2.2小鼠胚胎干細胞培養及質粒轉染 小鼠胚胎干細胞J1培養在明膠(0.1%明膠溶解于水中)處理過的細胞培養皿中，細胞培養液為高糖DMEM含有16% FBS，2 mmol/L L-谷氨酰胺，0.1 mmol/L的β巰基乙醇，1×雙抗(青霉素，鏈霉素)，1×非必需氨基酸，1 000 000 U/L LIF(Leukemia inhibitory factor),1 μmol/L PD0325901和3 μmol/L CHIR99021(2i，2 inhibitors)。將構建好的質粒使用Lipofectamine 3000轉染試劑按照轉染試劑說明書轉入細胞內。轉染后48 h消化細胞，然后重懸細胞，在含有終濃度為1 mg/L的嘌呤霉素培養液中培養48 h，最后細胞在不含抗性的培養液中繼續培養7 d。

1.2.3基因敲除細胞的鑒定 使用10 μL槍頭在體視顯微鏡下挑取胚胎干細胞單克隆，并將其轉入含有0.05%的胰酶中消化為單細胞，然后將2/3(板1)和1/3(板2)的細胞分別培養在兩個不同的96孔板中。72 h后，去除板2中的培養液，然后加入50 μL細胞裂解液，在55 ℃處理3 h，90 ℃處理20 min。最終取2 μL細胞裂解液進行PCR鑒定。Mbd1 PCR鑒定的上游引物序列為5′CGGGAGACGTTGGAAACTCA，下游引物為5′GAGCACACCCGTTACCTCTG。PCR條件為95 ℃ 3 min， 95 ℃ 10 s、63.5 ℃ 20 s、72 ℃ 40 s重復40次。最后瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物，并將獲得的PCR產物純化后進行測序鑒定，最終根據測序結果選擇板1中保留的基因敲除細胞擴大培養。

1.2.4胚胎干細胞克隆形態的觀察 Mbd1敲除和野生型胚胎干細胞在添加或者不添加抑制劑(2i)的培養液中培養3代，然后使用倒置相差顯微鏡觀察細胞的克隆形態并拍照。

1.2.5Mbd1蛋白檢測 取1.5×106個細胞在細胞裂解液中裂解后離心，取上清進行Western blot分析。蛋白在PAGE膠中分離后，使用半干轉膜的方法將蛋白轉印到硝酸纖維素膜上，并進行立春紅染色。然后使用3% 牛奶進行非特異性結合位點的封閉。之后使用Mbd1抗體和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidas，HRP)標記的二抗孵育，最后使用成像系統檢測發光信號。

2 結果

2.1 通過Crispr/Cas9技術獲得敲除Mbd1的小鼠胚胎干細胞

根據gRNA在線設計軟件(https://benchling.com/enterprise/crispr)在Mbd1基因轉錄起始位點附近設計gRNA，然后選擇敲除效率較高，但脫靶效率較低的gRNA進行后續實驗。通過體外合成的方式獲得gRNA序列后，將其連接于px459載體中，然后通過脂質體轉染的方式將構建成功的px459轉入小鼠胚胎干細胞中，最后通過PCR方法鑒定獲得敲除Mbd1的純合子細胞(圖1A)。基因組序列和測序結果相比對序列完全一致，說明細胞內并未發生Mbd1的敲除(圖1B上半部分)，如果在轉錄起始位點附近發生缺失，說明Mbd1基因序列發生了變化(圖1B下半部分)。另外，通過Western blot檢測細胞內是否還存在完整的Mbd1蛋白，如圖1C所示，敲除Mbd1的細胞總蛋白和野生型細胞中總蛋白相似的情況下(Ponceau S染色)，野生型胚胎干細胞在70 KDa附近能夠檢測到兩個條帶，分別為完整的Mbd1(Mbd1a)和缺失CXXC3的Mbd1(Mbd1b)，但是Mbd1敲除細胞在70 KDa附近并不能檢測到任何Mbd1的特異性條帶。

圖1 小鼠胚胎干細胞中Mbd1敲除的驗證Fig.1 The design of gRNA against Mbd1 and the efficiency of Mbd1 deletion in mESCs

2.2 敲除Mbd1的胚胎干細胞喪失了小鼠胚胎干細胞經典的3D克隆形態

為了驗證Mbd1對小鼠胚胎干細胞多能性維持的作用，Mbd1敲除和野生型小鼠胚胎干細胞分別在抑制劑(2i)存在(2iLIF)和缺少(-2i)情況下培養，培養3代后使用倒置相差顯微鏡觀察Mbd1對胚胎干細胞克隆形態的影響，結果顯示，在抑制劑存在的情況下，野生型小鼠胚胎干細胞呈現3D克隆形態(圖2左上)，當抑制劑去除的情況下，多數克隆呈現單層扁平形態，但是部分克隆仍然保持3D克隆形態(圖2左下)。和野生型胚胎干細胞相比較，敲除Mbd1的胚胎干細胞在抑制劑存在的情況下已經有部分克隆喪失了3D克隆形態(圖2右上)。當抑制劑去除后，幾乎所有的克隆喪失3D克隆形態，并且細胞表現出分化的狀態(圖2右下)。

注：標尺大小為1 000 μm圖2 敲除Mbd1小鼠胚胎干細胞及野生型小鼠胚胎干細胞的形態Fig.2 The effect of Mbd1 deletion on colony morphology of mESCs

2.3 敲除Mbd1對小鼠胚胎干細胞增殖的影響

為了驗證Mbd1是否能夠影響胚胎干細胞的增殖速度，實驗使用敲除Mbd1和野生型胚胎干細胞，在無抑制劑的情況下培養，并且每隔24 h左右收集細胞使用細胞計數法檢測細胞數量。如圖3所示，與野生型胚胎干細胞比較，敲除Mbd1的胚胎干細胞增殖速率明顯下降。實驗重復3次，圖中顯示結果為3次的平均值和標準差。

圖3 Mbd1敲除和野生型胚胎干細胞增殖速率Fig.3 The effect of Mbd1 deletion on cell proliferation rate of mESCs

3 討論

為了驗證基因的功能，基因敲除的方法已經得到廣泛應用[14]。在眾多的基因敲除方法中，Crispr/Cas9技術是比較常用的方法[15-16]。細胞瞬時表達gRNA和Cas9蛋白后，Cas9蛋白被gRNA特異性的定位于Mbd1轉錄起始位點附近，然后Cas9蛋白利用其核酸內切酶的活性將雙鏈DNA切開[17]。斷裂的DNA會依賴于細胞內的修復機制使得重新恢復到雙鏈DNA，但恢復過程中有可能會有新的堿基摻入和缺失(隨機修復)，因此會出現一些和原基因組無法匹配的堿基，最終造成Mbd1基因的編碼序列發生變化。基因轉錄起始位點被破壞后，合成的mRNA會尋找新的轉錄起始位點，因此，細胞內并不能表達完整的蛋白[19]。Mbd1在小鼠細胞中有不同的亞型，其分布和功能也不同[13,18-19]。在小鼠細胞中Mbd1主要有4種亞型，分別為Mbd1a、Mbd1b、Mbd1c及Mbd1d，不同亞型之間的功能區別主要取決于是否包含CXXC3結構域，完整的Mbd1蛋白預期大小為69.62 kDa，缺失CXXC3的蛋白大小為63.23 kDa[18-20]。由于本研究中敲除的位點位于轉錄起始位點處，轉錄起始位點的改變會影響到所有Mbd1亞型的表達，因此，所有Mbd1亞型不存在于本研究獲得的Mbd1敲除細胞中。

胚胎干細胞在體外培養過程中為了保持多能性，細胞內的通路蛋白起到了非常重要的作用。在眾多的通路中，PD0325901和CHIR99021抑制劑在胚胎干細胞體外培養中應用比較廣泛，并且效果較好。這2個抑制劑分別作用于FGF/MEK/ERK及Wnt/β-catenin信號通路，從而保證了多能性基因的正常表達，維持了胚胎干細胞的多能性[21]。在2i+LIF培養液中，Mbd1的敲除輕微的影響到小鼠胚胎干細胞的克隆形態。但當細胞在LIF培養液中培養3代后，敲除Mbd1的小鼠胚胎干細胞多數為單層細胞，失去了小鼠胚胎干細胞經典的3D克隆形態[22]。小鼠胚胎干細胞克隆形態的變化最終會影響到其多能性，因此推斷Mbd1對于小鼠胚胎干細胞多能性維持具有重要作用。

多能性胚胎干細胞具有非常短的細胞周期[23]，因此其在體外擴增過程中具有非常高的增殖速率。本研究結果表明，敲除Mbd1的胚胎干細胞其增殖速率較野生胚胎干細胞明顯下降，說明Mbd1對于胚胎干細胞的增殖具有非常重要的作用。Mbd1敲除后小鼠胚胎干細胞增殖速率變慢，從而不能快速的在體外增殖，可能最終喪失了多能性。

綜上所述，本研究成功獲得了敲除Mbd1的胚胎干細胞系，并且發現胚胎干細胞中Mbd1缺失后，細胞的增殖速率較野生型胚胎干細胞慢，Mbd1缺失后小鼠胚胎干細胞體外培養中經典的3D克隆形態消失，提示Mbd1對于胚胎干細胞多能性維持具有一定的作用。本研究結果也為胚胎干細胞分化為神經干細胞提供理論依據與實驗基礎。