肝細胞癌組織O-GlcNAc糖基化水平變化及其與血管生成素2表達的關系

王愛紅，趙菊梅，魏曉麗，龐秋霞，王明全

(1 延安大學醫學院，陜西延安716000；2 延安市腫瘤防治研究重點實驗室；3 延安大學附屬醫院)

肝癌是世界上癌癥相關死亡的主要原因之一，其中90%以上為肝細胞癌[1]。目前，肝細胞癌的病因和發病機制尚不完全清楚。O-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化修飾是一種存在于細胞核及細胞質的翻譯后修飾方式，可參與細胞的多種應激響應及細胞進程[2]。O-GlcNAc糖基轉移酶(OGT)和O-GlcNAc糖苷水解酶(OGA)是O-GlcNAc糖基化修飾過程中最重要的兩種酶。近年研究發現，蛋白質O-GlcNAc糖基化可參與惡性腫瘤的發生、發展[3]。血管生成素2(Ang2)是調節腫瘤血管生成的關鍵因子[4]。研究發現，在肝細胞癌組織中Ang2表達明顯升高，且其表達與腫瘤惡性程度和患者預后密切相關[5]。本研究探討了肝細胞癌組織O-GlcNAc糖基化水平變化及其與Ang2表達的關系?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年3月～2018年5月延安大學附屬醫院收治的初診肝細胞癌患者57例(觀察組)。所有患者入院前未行任何抗腫瘤治療，入院后接受手術治療并經術后組織病理檢查明確診斷。排除合并其他重要臟器嚴重疾病者、不配合治療者以及存在手術禁忌證者。其中，男37例、女20例，年齡(51.6±6.7)歲，BMI(23.86±2.60)kg/m2；腫瘤直徑：≤3 cm 27例，>3 cm 30例；組織學分級：Ⅰ級14例，Ⅱ級13例，Ⅲ級30例；BCLC分期：0、A期37例，B、C期20例；有淋巴結轉移43例，無淋巴結轉移14例。同期選擇接受手術治療的肝臟良性占位性病變患者40例(對照組)，男23例、女17例，年齡(52.4±8.1)歲，BMI(24.11±2.74)kg/m2；疾病類型：肝血管瘤28例、肝炎性假瘤2例、肝局灶性結節性增生4例、肝腺瘤性結節性增生3例、肝局灶性脂肪變3例。兩組性別、年齡、BMI具有可比性。本研究經延安大學附屬醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 OGA、OGT、Ang2表達檢測 ①OGA、OGT、Ang2 mRNA表達檢測：采用RT-PCR法。取手術切除的肝細胞癌組織及肝臟良性占位性病變組織，采用TRIzol法提取組織總RNA。取總RNA 1 μg，按High-Capacity RNA-to-cDNATMKit說明逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按2×SYBR Green qPCR Mix說明進行PCR擴增。所有引物由上海彩佑實業有限公司設計合成。引物序列：OGA上游引物5′-TTCACTGAAGGCTAATGGCTCCCG-3′，下游引物5′-ATGTCACAGGCTCCGACCAAGT-3′；OGT上游引物5′-CATCGAGAATATCAGGCAGGAG-3′，下游引物5′-CCTTCGACACTGGAAGTGTATAG-3′；Ang2上游引物5′-TCCAAGAGCTCGGTTGCTAT-3′，下游引物5′-AGTTGGGGAAGGTCAGTGTG-3′；β-actin上游引物5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3′。PCR反應體系共50 μL：2×SYBR Mixture(with ROX)25 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，RNase-free水補足至50 μL；反應條件：95 ℃ 10 min，95℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40個循環。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。②OGA、OGT、Ang2蛋白表達檢測：采用Westen blotting法。取手術切除的肝細胞癌組織及肝臟良性占位性病變組織，RIPA裂解液冰上充分裂解，提取組織總蛋白，經BCA法蛋白定量合格。加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白20 μL，SDS-PAGE(8%濃縮膠、5%分離膠)分離蛋白，并將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入OGA、OGT、Ang2、β-actin一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗，室溫孵育1 h。ECL發光，暗室中曝光、顯影。采用Odyssey紅外熒光掃描成像系統掃描各蛋白電泳條帶，Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 兩組OGA、OGT、Ang2 mRNA和蛋白表達比較 見表1。

表1 兩組OGA、OGT、Ang2 mRNA和蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 OGA、OGT表達與Ang2表達的關系 相關分析顯示，OGA、OGT mRNA表達與Ang2 mRNA表達均呈正相關關系(r分別為0.59、0.65，P均<0.05)，OGA、OGT蛋白表達與Ang2蛋白表達亦呈正相關關系(r分別為0.44、0.57，P均<0.05)。

2.3 肝細胞癌組織OGA、OGT、Ang2蛋白表達與患者臨床病理特征的關系 見表2。

表2 肝細胞癌組織OGA、OGT、Ang2蛋白表達與患者臨床病理特征的關系

3 討論

O-GlcNAc糖基化修飾是一種重要的翻譯后修飾方式。近年研究發現，蛋白質O-GlcNAc糖基化可參與惡性腫瘤的發生、發展[3]。OGT可增加p-JNK、p-c-Jun蛋白表達和AP-1激活，從而激活JNK/c-Jun/AP-1級聯反應，并提高p-IKKα/β、p-p65、p-p50、NF-κB的DNA結合活性，激活NF-κB信號通路，促進腫瘤生長和轉移[6]。糖基化終末產物特異性受體能夠通過該蛋白在Ser73上的O-GlcNAc糖基化提高原癌蛋白c-Jun的活性和穩定性[7]。OGT蛋白還可調節E-選擇素基因的啟動子活性、抑制cAMP反應元件、增強AP-1和E-選擇素表達，促進惡性腫瘤浸潤和侵襲[8]。OGA能去除O-GlcNAc糖基化修飾。有研究發現，乳腺癌組織OGA活性明顯升高，其活性越高，腫瘤侵襲性越強[9]。以上結果表明，O-GlcNAc糖基化可能在惡性腫瘤的發生、發展中具有重要作用。

血管生成是腫瘤形成中的標志性事件。Tie2是內皮細胞上特異的酪氨酸激酶型受體，為Ang1和Ang2的共同受體。Ang1作為促血管生成因子，能夠通過激活并磷酸化Tie2，促進血管成熟并維持血管結構。Ang2作為Ang1的拮抗劑，能夠競爭性抑制Ang1的作用，從而降低血管穩定性。腫瘤組織Ang2表達升高，可促進腫瘤生成、侵襲和轉移[10]。Chen等[5]研究發現，肝癌組織Ang2 mRNA表達明顯升高，且其高表達與患者預后不良明顯相關；而使用特異性shRNA抑制Ang2表達，肝癌細胞增殖速率明顯受到抑制。結果表明，Ang2可能在肝細胞癌的發生、發展中具有重要作用。

O-GlcNAc糖基化與腫瘤血管生成的關系是目前臨床研究的熱點。果糖-6-磷酸酰胺轉移酶1(GFAT1)是己糖胺生物合成途徑(HBP)中的限速酶，控制著O-GlcNAc糖基化修飾過程。GFAT1/HBP是血管內皮生長因子(VEGF)調控血管生成的重要通路[11]。前列腺癌PC3-ML細胞中O-GlcNAc糖基化水平下降可導致MMP-2、MMP-9、VEGF表達下調，從而抑制腫瘤侵襲和血管生成[12]。此外，O-GlcNAc糖基化可增強絨毛膜癌JARR細胞黏附能力，促進腫瘤細胞遷移。有研究還發現，SP3蛋白的O-GlcNAc糖基化修飾水平增加可導致Ang2啟動子中葡萄糖反應性GC盒結合降低，導致Ang2表達增加[13]。由此推測，O-GlcNAc糖基化與腫瘤血管生成密切相關。

本研究結果顯示，觀察組OGA、OGT、Ang2 mRNA和蛋白表達均明顯高于對照組；相關分析顯示，OGA、OGT表達與Ang2表達均呈正相關關系；肝細胞癌組織OGA、OGT、Ang2蛋白表達均與BCLC分期有關，OGT、Ang2蛋白表達還與淋巴結轉移有關。提示三者均參與肝細胞癌的發生、發展，并且O-GlcNAc糖基化與Ang2具有協同促進作用。但O-GlcNAc糖基化與Ang2的協同作用機制還需進一步研究。

綜上所述，肝細胞癌組織O-GlcNAc糖基化水平明顯升高；O-GlcNAc糖基化有可能通過調節Ang2表達促進肝細胞癌的發生、發展。