人ADSCs移植對大鼠急性重癥胰腺炎的治療作用及其機制

唐楠，譚雪瑩，張德國，黃飛，史光軍

(1 濰坊醫學院，山東濰坊261000；2 青島大學附屬青島市市立醫院；3 大連醫科大學)

急性重癥胰腺炎(SAP)是臨床常見的急危重癥，起病急驟，病情兇險，是外科急腹癥中最棘手的疾病之一。目前，對于SAP的發病機制尚不完全清楚，一般認為與胰腺自身消化引起的瀑布式炎癥級聯效應有關；對于SAP的治療主要采取非手術為主的個體化綜合治療，如胃腸減壓、抑制消化液分泌、液體復蘇等對癥支持治療。近年隨著治療方法的改進，SAP的臨床救治成功率不斷提高，但其病死率仍然在10%左右[1，2]。干細胞移植是將具有自我復制能力的多潛能細胞移植到患者體內,修復或替換受損細胞或組織，從而達到治療疾病的目的。有研究報道，通過尾靜脈移植骨髓間充質干細胞(BMSCs)能夠減輕SAP大鼠胰腺炎癥反應[3]。但BMSCs來源匱乏，不適合治療性研究。脂肪間充質干細胞(ADSCs)是來源于脂肪組織的多潛能細胞，其作用效果與BMSCs相似，而且組織相容性復合體Ⅰ低表達，可逃避免疫系統識別，無需配型[4]。此外，脂肪組織來源廣泛，ADSCs取材容易[5]。有研究發現，在大鼠體內ADSCs向胰島細胞分化、增殖和遷移的能力均明顯優于BMSCs[6，7]。本課題組前期研究證實，ADSCs能明顯減輕SAP大鼠胰腺炎癥反應。但對ADSCs治療SAP的具體作用機制仍不十分清楚。2018年5～6月，本研究觀察了人ADSCs對大鼠SAP的治療作用及其可能的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠45只，清潔級，鼠齡40～50 d，體質量200～230 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物許可證號：SCXK(魯)20140007。所有大鼠分籠飼養，每籠5只。飼養環境溫度18～25 ℃、相對濕度40%～60%，光照12 h明暗交替。實驗期間自由攝食、飲水。人ADSCs由青島市市立醫院肝膽胰外科細胞移植實驗室凍存。所有PCR引物由北京賽百盛基因技術有限公司設計合成。Light Cycle96實時熒光定量PCR儀，瑞士Roche公司；流式細胞儀，美國BD公司。PrimeScript RT Reagent Kit，日本TaKaRa公司；iQTMSYBR Green Supermix，美國Sigma公司；兔抗鼠磷酸化β-actin(p-β-actin)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB)一抗，沈陽萬類生物科技有限公司；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，南京生興生物技術有限公司。

1.2 動物分組處理 所有SD大鼠適應性喂養1周，隨機分為假手術組、模型組、移植組，每組15只。各組術前禁食12 h，自由飲水。模型組、移植組異氟烷吸入麻醉，經上腹劍突下正中切口入腹，用微型血管夾夾閉膽總管近肝門處，按胰膽管逆行注射牛磺膽酸鈉法[8]建立SAP模型。當觀察到胰腺充血、水腫，移植組用注射器于胰腺被膜下注射密度為1×106個/mL的人ADSCs懸液300 μL后關腹。模型組觀察到胰腺充血、水腫后關腹。假手術組開腹后經胰膽管逆行注射臺式液。

1.3 各組腹水量與血清淀粉酶、TNF-α檢測 ①腹水量檢測：移植組于移植6、12、24 h分別取5只，假手術組與模型組同期各取5只，異氟烷吸入麻醉滿意后，平臥位固定于手術臺上，開腹，用5 mL注射器抽取腹水，記錄腹水量。②血清淀粉酶、TNF-α檢測：抽取腹水后，心尖部采血，4 ℃靜置3 h，3 000 r/min離心10 min，取上層血清。采用ELISA法檢測血清淀粉酶、TNF-α。

1.4 胰腺組織形態學觀察 各組心尖部取血后，斷頸處死，迅速完整分離胰腺組織。取部分胰頭組織，4%多聚甲醛固定，常規脫水、包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察胰頭組織形態學改變。

1.5 胰頭組織p-AKT、p-NF-κB mRNA與蛋白表達檢測 ①胰頭組織p-AKT、p-NF-κB mRNA表達檢測：采用RT-PCR法。取血清淀粉酶、TNF-α水平變化最明顯時胰頭組織，采用TRIzol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可進行后續實驗。按PrimeScript RT Reagent Kit說明將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按iQTMSYBR Green Supermix說明進行PCR擴增。引物序列：p-AKT上游引物5′-GTGCTGGAGGACAATGACTACGG-3′，下游引物5′-AGCAGCCCTGAAAGCAAGGA-3′；p-NF-κB上游引物5′-CTACTGTTCAGTGTTCAAGCAGTGA-3′，下游引物5′-CAGTGCAATATAGCATTGCAGTAGC-3′；β-actin上游引物5′-GCCAACCGTGAAAAGATG-3′，下游引物5′-CCAGGATAGAGCCACCAAT-3′。PCR反應體系共10 μL：2×Easy Taq PCR Supermix 5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，雙蒸水1 μL；反應條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s共30個循環，最后72 ℃ 10 min。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。②胰頭組織p-AKT、p-NF-κB蛋白表達檢測：采用Western blotting法。取血清淀粉酶、TNF-α水平變化最明顯時胰頭組織，RIPA裂解液冰上充分裂解，提取組織總蛋白，經BCA法蛋白定量合格。然后加入4×上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白12 μg，經SDS-PAGE分離蛋白(5%濃縮膠、10%分離膠)，80 V電壓電泳30 min，當溴酚藍跑至分離膠時，更換至120 V電壓，直至溴酚藍跑至凝膠底部，結束電泳。采用濕轉法將蛋白電泳產物轉印至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2～3 h，分別加入p-β-actin(稀釋比1∶2 000)、p-AKT(稀釋比1∶200)、p-NF-κB(稀釋比1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(稀釋比1∶2 000)，室溫孵育2 h。最后ECL發光，暗室中曝光、顯影，實時熒光檢測系統拍照。采用Image-Pro Plus6.0軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以β-actin為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組移植不同時間腹水量和血清淀粉酶、TNF-α水平比較 假手術組移植6、12、24 h腹水色清、量少，血清淀粉酶、TNF-α水平變化不明顯。模型組移植6 h即有大量紅褐色腹水，隨著移植時間延長逐漸增多，血清淀粉酶、TNF-α水平在移植24 h內先升高后降低。移植組移植6、12、24 h腹水量較模型組同期均降低，但差異均無統計學意義；而血清淀粉酶、TNF-α水平較模型組同期均明顯降低(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組胰頭組織形態學觀察 假手術組胰腺組織結構清晰，大部分腺泡小葉完整，無明顯炎性細胞浸潤，未見間質充血、出血和腺泡細胞壞死；隨著時間推移，胰腺組織和細胞并未見明顯改變。模型組胰腺組織結構不清，腺泡小葉結構破壞，組織間隙水解消失，小葉間水腫，胰腺細胞無法辨認，伴有大量炎性細胞浸潤，并有明顯出血灶和壞死灶；隨著時間推移，胰腺組織水解、細胞壞死及炎性細胞浸潤逐漸加重。移植組胰腺組織結構尚清晰，組織間隔清楚，胰腺細胞腫脹，伴有少量炎性細胞浸潤，偶見點狀出血，未見腺泡細胞壞死。隨著時間推移，胰腺組織水解、炎性細胞浸潤進一步加重，但仍可見其基本結構。

表1 各組不同時間腹水量和血清淀粉酶、TNF-α水平比較

注：與假手術組同期比較，*P<0.05；與模型組同期比較，#P<0.05。

2.3 各組胰腺組織p-AKT、p-NF-κB mRNA與蛋白表達比較 見表2。

表2 各組胰腺組織p-AKT、p-NF-κB mRNA與蛋白相對表達量比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

隨著對SAP發病機制的深入研究和臨床救治水平的提高，其病死率得到明顯控制，已降至10%左右[9，10]。目前關于SAP具體的發病機制尚不完全清楚，比較公認的是“二次打擊”學說。所謂“二次打擊”就是急性胰腺炎早期，胰腺組織損傷后釋放大量炎性因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β等，在血液循環中形成第一次高峰，這些炎性介質可導致腸黏膜屏障功能障礙，進而引起腸道菌群易位，形成內毒素血癥，從而導致胰腺組織繼發感染、炎性因子瀑布式激活、炎性細胞浸潤，造成胰腺組織水腫、出血和壞死，進一步發展為全身炎性反應綜合癥和多器官功能衰竭[11]。而NF-κB作為這一機制的“扳機點”，其作用更是不可小覷[12,13]。NF-κB是一種多向性核轉錄因子調節蛋白，作為SAP發病機制的核心環節之一，一方面NF-κB激活可上調細胞內P-選擇素、細胞間黏附因子1表達，從而使多形核中性粒細胞趨化而貼壁和滲出，進而導致胰腺組織水腫與炎性細胞浸潤[11]；另一方面NF-κB激活后，迅速入核與特定的基因啟動子或增強子結合，從而上調其細胞因子和炎性因子基因轉錄與表達，導致血清TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性介質水平明顯升高，進而造成“炎癥瀑布”[14]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號轉導通路是介導細胞外信號引起細胞反應的重要信號調控系統，可參與機體多種病理生理過程，如腫瘤形成、應激反應、炎性反應等。有研究發現，抑制PI3K/AKT信號轉導通路可明顯減輕膿毒血癥、長期機械通氣所引起的炎性反應[15,16]；而且PI3K/AKT信號轉導通路能夠介導SAP大鼠中性粒細胞活化及炎性因子TNF-α、IL-1β生成[17]。目前認為，作為PI3K下游靶蛋白的AKT活化后，可使抑制蛋白IκBa磷酸化，繼而激活NF-κB[18，19]。這些理論為SAP治療提供了新的方向。

干細胞移植作為當今社會新興的再生醫療技術，在治療神經系統、免疫系統等疾病方面較傳統治療方法具有不可比擬的效果。根據干細胞來源不同，可分為BMSCs、ADSCs、胰腺干細胞等。針對SAP治療，最理想的是胰腺干細胞，但由于其數量少、提純困難等因素，無法滿足臨床治療需要。已有研究證實，BMSCs、ADSCs亦能定向分化為胰腺細胞[20，21]。但BMSCs來源匱乏，不適合治療性研究。ADSCs的作用效果與BMSCs相似，而且組織相容性復合體Ⅰ低表達，可逃避免疫系統識別，無需配型[4]。此外，脂肪組織來源廣泛，ADSCs取材容易[5]。本課題組前期研究證實，人ADSCs經大鼠尾靜脈注射，可定向遷移至胰腺組織，發揮相應的修復或治療作用。但目前對ADSCs治療SAP的具體作用機制尚不清楚。

本課題組前期研究發現，人ADSCs經SAP大鼠尾靜脈注射，可抑制體內TNF-α、IL-6、IL-10等炎性因子釋放[22～24]。本研究結果發現，隨著移植時間延長，移植組和模型組腹水量較假手術組均逐漸增多，雖然移植組各時間腹水量均低于模型組，但差異無統計學意義；移植組和模型組各時間血清淀粉酶、TNF-α水平均明顯高于對照組，但移植組血清淀粉酶、TNF-α水平較模型組同期均明顯降低；移植組胰頭組織水腫、壞死及炎性細胞浸潤情況均較模型組輕微。結果表明人ADSCs移植對大鼠SAP具有一定治療作用。進一步研究發現，模型組p-AKT、p-NF-κB mRNA與蛋白相對表達量均明顯高于假手術組，而移植組p-AKT、p-NF-κB mRNA與蛋白相對表達量均明顯低于模型組。表明人ADSCs可能是通過抑制AKT磷酸化進而抑制NF-κB激活，產生弱化“二次打擊”扳機點作用，而且這種作用在炎癥早期較為明顯，隨著炎癥時間推移逐漸減弱。這為SAP早期ADSCs移植治療奠定了基礎。

綜上所述，人ADSCs移植對大鼠SAP具有一定治療作用，其作用機制可能與抑制AKT磷酸化進而抑制NF-κB激活，繼而產生弱化“二次打擊”扳機點作用有關。但本研究尚有許多不足之處，如各指標觀察時間過長、炎癥因子TNF-α釋放減少的分子機制是抑制AKT磷酸化的證據相對不足等，這些問題有待于今后進一步研究論證。