結腸癌組織RASGRF1蛋白表達與基因甲基化狀態變化及其臨床意義

錢偉明，王海燕，李可

(常州市武進中醫醫院，江蘇常州213161)

結腸癌是臨床常見的消化系統惡性腫瘤，近年來其發病率和病死率在我國呈明顯上升趨勢，已成為當今社會嚴重危脅居民健康的疾病之一[1]。結腸癌早期常無明顯癥狀，多數患者就診時已屬中晚期，即使能夠手術，也易出現轉移和復發，患者5年生存率較低[2，3]。但目前對結腸癌發病的分子機制仍不十分清楚。Ras超家族是真核生物中普遍存在的一類小分子GTP結合蛋白，通過介導生長因子、細胞因子和多種細胞外信號傳導通路，調控細胞的生長、增殖、分化等生物學過程[4]。Ras超家族許多成員是癌基因，其基因突變或蛋白異常表達可導致腫瘤形成[5,6]。Ras蛋白特異性鳥苷酸釋放因子1(RASGRF1)是Ras蛋白的上游信號分子之一，能夠調控Ras蛋白表達。Deng等[7]研究發現，RASGRF1可作為星形細胞瘤的治療靶點之一。甲基化是一種重要的表觀遺傳學修飾方式，特定基因的甲基化可作為惡性腫瘤發生、發展的標志[8]。有研究證實，RASGRF1異常甲基化與胃癌的發生密切相關[9]。但目前鮮見RASGRF1蛋白表達及其基因甲基化狀態與結腸癌關系的報道。為此，我們進行了本研究，旨在探討RASGRF1在結腸癌發生、發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月～2017年12月常州市武進中醫醫院收治的初診結腸癌患者81例。納入標準：①經術后組織病理檢查明確診斷；②初診，術前未行任何抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并嚴重影響免疫組化或甲基化特異性PCR(MSP)檢查結果的疾病者；③結腸癌組織邊界不清，難以取得癌旁非腫瘤組織者；④臨床病理資料不完整者。其中，男55例、女26例，年齡29～81歲(<50歲19例、≥50歲62例)；腫瘤直徑：<4 cm 38例，≥4 cm 43例；TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期35例，Ⅲ期39例；組織分化程度：高分化9例，中分化37例，低分化35例；有淋巴結轉移45例，無淋巴結轉移36例。本研究經常州市武進中醫醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

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1.2 RASGRF1蛋白表達檢測 采用免疫組化法。取手術切除的結腸癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣>5 cm)，常規石蠟包埋，10 μm厚連續切片。切片經65 ℃烤片3 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。Tris-EDTA抗原修復液(pH 9.0)煮沸以修復抗原，自然冷卻至室溫。PBS沖洗5 min×3次，3% H2O2避光孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶活性；PBS沖洗5 min×3次，10%正常羊血清封閉10 min，加入兔抗人RASGRF1一抗，4 ℃孵育過夜。次日，PBS沖洗5 min×3次，加入酶標抗兔聚合物二抗，室溫孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知RASGRF1抗原陽性切片作為陽性對照。

通過對教學知識點及技能點的分析梳理，結合電商職業技能鑒定要求，擬建實踐教學基地建筑面積約200平方米，按照企業實際電商工作場景，引入企業真實工作沒項目，設置4個電商(商務秘書)職業場景實驗室，細分為19個具體項目，配置76個標準工作位，并依據企業真實項目靈活調整，以培養學生電商(商務秘書)實踐應用和創新創業能力為目標，將企業真實工作項目融入電商實踐課程。使教學內容具體化、任務化、場景化。每個項目任務都是電商(商務秘書)一項場景實驗室系列學習任務，教學內容安排圍繞電商場景實驗室任務來完成。

采用雙盲法由兩位病理科高年資醫師獨立閱片。RASGRF1蛋白陽性染色定位于細胞質，呈黃色至棕褐色，顆粒狀。每張切片隨機選取4個400倍不重疊視野，每視野計數至少100個細胞，評價染色強度，并計數陽性細胞比例。染色強度評分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞比例評分：≤5%為0分，>5%～33%計1分，>33%～66%計2分，>66%為3分。根據染色強度評分和陽性細胞比例評分綜合評價，二者乘積≥2為RASGRF1蛋白陽性表達。

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1.4 統計學方法 采用SPSS22.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

1.3 RASGRF1基因甲基化檢測 采用MSP法。取手術切除的結腸癌組織及其配對的癌旁正常組織，按Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit說明提取組織DNA，經核酸蛋白分析儀鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0，可用于后續實驗。取組織DNA 2 μg，加入去離子水稀釋至50 μL，與3 mol/L氫氧化鈉溶液5.5 μL混勻，37 ℃水浴30 min；加入10 mmol/L氫醌30 μL，輕輕震蕩混勻；再加入3.6 mol/L亞硫酸氫鈉(pH 5.0)520 μL，輕輕震蕩混勻；-20 ℃保存備用。所有引物由上海銘博生物科技有限公司設計合成。甲基化特異性引物：上游引物5′-TTGGACGTTTTTTGTAGTTTTATTTC-3′，下游引物5′-CCCGAAAATTTACGTCTTTACG-3′；非甲基化特異性引物：上游引物5′-TGGATGTTTTTGTAGTTTTATTTTGT-3′，下游引物5′-CATCCCAAAAATTTACATCTTTACAC-3′。PCR反應體系共25 μL：2×HotStar Taq PCR Buffer 10 μL，dNTP Mix 2 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，去離子水11 μL；反應條件：95 ℃預變性15 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共40個循環，最后72 ℃延伸3 min。取PCR擴增產物10 μL，1%瓊脂糖凝膠電泳分離甲基化與非甲基化條帶，采用凝膠成像儀于紫外線下拍照分析。結果判定：電泳結果中出現甲基化條帶伴或不伴非甲基化條帶擴增，判定為甲基化；電泳結果中僅出現非甲基化條帶擴增，而未出現甲基化條帶擴增，判定為非甲基化。

2 結果

2.3 結腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達及其基因甲基化陽性與患者臨床病理特征的關系 結腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無關(P均>0.05)；結腸癌組織RASGRF1基因甲基化陽性與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無關(P均>0.05)。見表1。

RASGRF1基因是一種Ras蛋白激活因子，定位于人染色體25q15，長6 313 bp。RASGRF1是一種父系印記基因，其編碼的RASGRF1蛋白能促進Ras蛋白從Ras-GDP復合體中解離，進而與GTP結合形成Ras-GTP，從而激活特定的Ras信號通路。研究證實，RASGRF1能夠激活的Ras蛋白有K-Ras、H-Ras、N-Ras[12,13]。RASGRF1蛋白還可經DHPH2介導直接與微管相連[11]，繼而參與細胞的諸多生物學過程。由于RASGRF1蛋白在神經系統中表達較高，目前關于RASGRF1蛋白的研究主要集中在中樞或外周神經系統疾病[14]。近年研究發現，RASGRF1在多種惡性腫瘤的發生、發展中亦具有重要作用[15,16]。Zhu等[15]研究發現，RASGRF1蛋白可參與調控黑色素瘤細胞中基質金屬蛋白酶生成，從而影響腫瘤的侵襲和轉移；Sacco等[16]研究發現，無論是動物實驗還是細胞實驗，RASGRF1相關的衍生肽均可通過抑制Ras蛋白，達到抑制腫瘤細胞增殖和遷移。本研究結果發現，結腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達率明顯低于癌旁正常組織；結腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移有關，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無關。結果表明，RASGRF1蛋白在結腸癌組織中低表達，其低表達與腫瘤侵襲和轉移有關。

2.1 結腸癌組織與癌旁正常組織RASGRF1蛋白表達與基因甲基化比較 結腸癌組織與癌旁正常組織RASGRF1蛋白陽性表達率分別為37.04%(30/81)、91.36%(74/81)，RASGRF1基因甲基化陽性率分別為70.37%(57/81)、18.52%(15/81)。結腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達率明顯低于癌旁正常組織(χ2=51.995，P<0.01)，RASGRF1基因甲基化陽性率明顯高于癌旁正常組織(χ2=44.100，P<0.01)。

表1 結腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達及其基因甲基化陽性與患者臨床病理特征的關系

3 討論

近年來，盡管我國臨床診療水平有了明顯提高，但受居民飲食結構、生活習慣、環境變化等因素影響，結腸癌的發病率和病死率并未呈現出全球范圍內的下降趨勢，反而呈上升趨勢[10]。中國癌癥統計數據顯示，2015年我國結腸癌新發病例37.6萬、死亡病例19.1萬，其發病率和病死率均居所有惡性腫瘤的第5位[11]。目前對結腸癌發病的具體分子機制仍不十分清楚。因此，探索與結腸癌發生、發展相關的分子機制具有重要意義。

2.2 結腸癌組織RASGRF1蛋白表達與RASGRF1基因甲基化的關系 Spearman等級相關分析顯示，結腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達與RASGRF1基因甲基化陽性呈負相關關系(ρ=-0.486，P<0.05)。

表觀遺傳學在基因表達的相關調控機制中具有重要作用。其中，DNA甲基化是表觀遺傳學修飾的主要方式之一。DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶作用下，S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉移至胞嘧啶第5位碳原子上，從而形成5-甲基胞嘧啶[17]。編碼蛋白質基因的高甲基化狀態能直接阻礙基因轉錄，一般認為DNA非甲基化與基因活化相關，而DNA甲基化則與基因沉默相關，異常的DNA甲基化可導致基因表達異常。不同于基因突變等不可逆的經典遺傳學現象，DNA甲基化是一種可逆的動態過程，去甲基化基因可恢復其活性。因此，將異常甲基化的抑癌基因或促癌基因去甲基化有可能抑制腫瘤的發生、發展[18]。有研究發現，RASGRF1基因異常甲基化不僅與神經系統疾病有關，如腦外傷昏迷、癲癇發作等[19，20]，還可參與惡性腫瘤的發生、發展。如Klose等[8]研究發現，RASGRF1基因甲基化異常升高可增加人群罹患胃癌的風險。本研究結果顯示，結腸癌組織RASGRF1基因甲基化陽性率明顯高于癌旁正常組織；結腸癌組織RASGRF1基因甲基化陽性與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移有關，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無關。表明RASGRF1基因甲基化陽性在結腸癌組織中高表達，其高表達與腫瘤侵襲和轉移有關。

Konstantinopoulos等[32]通過研究證實，SAHA聯合聚PARP抑制劑對卵巢癌細胞的協同作用可能與DNA的同源重組相關。同源重組DNA修復途徑中，成員發生頻繁的遺傳學和表觀遺傳學改變是漿液性上皮性卵巢癌的特征是，多數存在不同程度的同源重組修復缺陷。PARP抑制劑是針對同源重組缺陷腫瘤的靶向治療藥物，而對具有完整同源重組途徑的上皮性卵巢癌治療作用差。實驗觀察發現，經SAHA處理后的巢癌細胞中同源重組途徑的相關基因RAD51和BRCA1表達下調，并且在體內、體外實驗中都能夠增加PARP抑制劑對于卵巢癌細胞的毒性作用，證實SAHA的抗腫瘤機制與DNA的同源重組關系密切[32]。

為進一步確定RASGRF1基因甲基化狀態與其編碼蛋白表達的關系，本研究分析了結腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達與RASGRF1基因甲基化陽性的關系。結果發現，結腸癌組織RASGRF1蛋白陽性表達與RASGRF1基因甲基化陽性呈負相關關系。說明結腸癌組織RASGRF1基因甲基化異常升高是RASGRF1蛋白表達下降的重要原因。進一步推斷RASGRF1基因去甲基化可能是未來結腸癌治療的研究方向之一。

綜上所述，結腸癌組織RASGRF1蛋白低表達、RASGRF1基因甲基化異常升高，二者呈負相關關系，且均與腫瘤TNM分期和淋巴結轉移有關。