胃癌組織lncRNA H19、miR-141表達變化及其與患者臨床病理特征和預后的關系

李超，王輝，洪建，孟松，邵永，朱孝成

(徐州醫科大學附屬醫院，江蘇徐州221006)

胃癌是臨床常見的消化系統惡性腫瘤，其病因和發病機制尚未完全明確[1]。根治性手術切除是目前惟一能夠治愈胃癌的手段，但由于胃癌早期癥狀不明顯，多數患者就診時已處于中晚期，無法進行根治性手術，即使可以手術切除，也易出現復發和轉移，患者預后較差[2]。因此，迫切需要闡明胃癌發病的分子機制，以便尋找理想的早期診斷標志物以及高效特異的治療靶點。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，不具有蛋白質編碼功能，但可在轉錄或轉錄后水平調控基因表達[3]。近年研究發現，lncRNA還可參與腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡等生物學過程。H19是第一個被發現與腫瘤相關的lncRNA，長度為2.3 kb，在胚胎組織中高表達，在成年組織中一般不表達，但在腫瘤發生時被重新激活。有研究發現，胃癌細胞lncRNA H19高表達，其高表達能夠促進腫瘤細胞的增殖和侵襲并抑制其凋亡[4]。微小RNA(miRNA)是一類在進化上高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，可參與人類近1/3基因的表達調控，在發育時序控制、細胞增殖和凋亡調控等方面具有重要作用[5]。miR-141是miR-200家族的成員之一，在上皮性卵巢癌細胞中表達上調，而在胃癌細胞中表達下調[6，7]，其在惡性腫瘤中的生物學效應可能具有雙向性。目前臨床上關于胃癌組織lncRNA H19、miR-141表達變化及其與患者臨床病理特征和預后關系的報道較少。為此，我們觀察了胃癌組織lncRNA H19、miR-141表達變化，并分析其表達變化與患者臨床病理特征和預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月～2015年12月徐州醫科大學附屬醫院收治的胃癌患者81例。所有患者經術后組織病理檢查證實。納入標準：①符合胃癌診斷；②初診；③采用根治性或姑息性手術切除，術前未行任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤、全身感染性疾病以及肝、腎等重要臟器嚴重疾病者；②術前接受任何抗腫瘤治療者；③臨床病理資料或隨訪資料不完整者。其中，男57例、女24例，年齡20～70歲(<60歲47例、≥60歲34例)；腫瘤直徑：>5 cm 41例，≤5 cm 40例；浸潤深度：黏膜下各層33例，漿膜層48例；組織分化程度：低分化30例，中高分化51例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期56例，Ⅲ、Ⅳ期25例；有淋巴結轉移44例，無淋巴結轉移37例。本研究經徐州醫科大學附屬醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 lncRNA H19、miR-141表達檢測 采用RT-qPCR法。取手術切除的胃癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣≥5 cm)，采用TRIzol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA純度和濃度合格，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，提取的總RNA完整，可用于后續實驗。按HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase說明將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按LightCycler 480 SYBRGreen Ⅰ Master說明進行PCR擴增。所有引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成。lncRNA H19上游引物5′-ACCACTGCACTACCTGACTC-3′，下游引物5′-CCGCAGGGGGTGGCCATGAA-3′；內參GAPDH上游引物5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游引物5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′。miR-141上游引物5′-GGGCATCTTCCAGTACAGT-3′，下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；內參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。按試劑盒說明配制PCR反應體系。PCR反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 15 s共45個循環。以GAPDH或U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 隨訪 所有患者出院后采用電話或門診等方式定期隨訪，每2個月隨訪1次，隨訪截至2018年12月31日，隨訪時間1～60個月，統計患者術后生存時間和術后5年生存率。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織lncRNA H19、miR-141表達比較 胃癌組織與癌旁正常組織lncRNA H19相對表達量分別為6.25±2.31、1.06±0.21，miR-141相對表達量分別為0.52±0.13、1.01±0.19。胃癌組織lncRNA H19相對表達量明顯高于癌旁正常組織，miRNA-141相對表達量明顯低于癌旁正常組織(P均<0.01)。

2.2 胃癌組織lncRNA H19、miR-141表達與患者臨床病理特征的關系 胃癌組織lncRNA H19相對表達量與腫瘤直徑、浸潤深度、TNM分期、遠處轉移有關(P均<0.05)，與患者性別、年齡、組織分化程度無關(P均>0.05)；胃癌組織miR-141相對表達量與腫瘤直徑、組織分化程度、TNM分期有關(P均<0.05)，與患者性別、年齡、浸潤深度、遠處轉移無關(P均>0.05)。見表1。

表1 胃癌組織lncRNA H19、miR-141表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 胃癌組織lncRNA H19表達與miR-141表達的關系 以胃癌組織lncRNA H19或miR-141相對表達量的均數為界，將患者分為lncRNA H19、miR-141低表達者與高表達者。其中，lncRNA H19低表達者40例、高表達者41例，miR-141低表達者39例、高表達者42例。lncRNA H19高表達者中，miR-141低表達者31例、高表達者10例；lncRNA H19低表達者中，miR-141低表達者8例、高表達者32例。Spearman相關分析顯示，胃癌組織lncRNA H19相對表達量與miR-141相對表達量呈負相關關系(r=-0.954，P<0.05)。

2.4 胃癌組織lncRNA H19、miR-141表達與患者預后的關系 Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，lncRNA H19高表達者與低表達者術后生存時間分別為(28.00±3.20)、(44.00±8.70)個月，術后5年生存率分別為26.83%(11/41)、50.0%(20/40)，二者比較差異均有統計學意義(t/χ2分別為11.037、4.601，P均<0.05)；miR-141高表達者與低表達者術后生存時間分別為(46.00±11.33)、(27.00±3.12)個月，術后5年生存率分別為50.00%(21/42)、25.60%(10/39)，二者比較差異均有統計學意義(t/χ2分別為10.118、4.189，P均<0.05)。

3 討論

胃癌的發生、發展是多因素、多基因參與的復雜過程[8]，其病因和發病機制尚不完全清楚。由于胃癌早期癥狀不典型，多數患者出現明顯癥狀就診時已屬中晚期，錯過了最佳根治性手術時機，即使可以手術切除，術后也極易復發和轉移，患者預后較差[9]。因此，迫切需要闡明胃癌發病的分子機制，以便尋找更理想的早期診斷標志物以及高效特異的治療靶點。

近年隨著基因組測序技術不斷發展，越來越多沒有蛋白質編碼功能的RNA被發現，這些非編碼RNA在腫瘤的發生、發展過程中具有重要作用[10，11]。目前，臨床研究最多的非編碼RNA是lncRNA和miRNA，它們在調控腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學過程中發揮著不可替代的作用[12]。

lncRNA H19是第一個被發現與腫瘤相關的lncRNA，定位于人染色體11p5.5，包含5個外顯子和4個內含子，可在表觀遺傳和轉錄水平上調控細胞增殖、分化和凋亡[13]。有研究發現，在食管癌、肝癌、結腸癌、乳腺癌組織lncRNA H19表達上調，其表達變化與腫瘤惡性生物學行為密切相關[14～17]。近年研究發現，胃癌細胞lncRNA H19高表達，其高表達可促進胃癌細胞增殖并抑制其凋亡[18]。本研究結果顯示，胃癌組織lncRNA H19相對表達量明顯高于癌旁正常組織；胃癌組織lncRNA H19相對表達量與腫瘤直徑、浸潤深度、TNM分期、遠處轉移有關，與患者性別、年齡、組織分化程度無關。以上結果表明，lncRNA H19在胃癌的發生、發展過程中具有促癌作用，并且其表達上調與胃癌的惡性進展密切相關。本研究結果還發現，lncRNA H19高表達者術后生存時間和術后5年生存率均明顯低于lncRNA H19低表達者，表明lncRNA H19有可能作為胃癌預后判斷的生物標志物。

miRNA是一類高度保守的非編碼小分子RNA，作為一種重要的轉錄后基因調控元件，在腫瘤的發生、發展過程中具有重要作用，有可能成為腫瘤早期診斷和預后判斷的生物標志物[19～21]。miR-141定位于人染色體12p13.31，是miR-200家族的成員之一。miR-141在不同惡性腫瘤中的表達不盡相同[22]。有研究發現，在胃癌細胞中miR-141低表達，低表達的miR-141能夠通過靶向調控信號轉導子和轉錄激活因子4，從而發揮抑癌作用[23]；而在非小細胞肺癌細胞中miR-141高表達，高表達的miR-141可通過靶向調控PHLPP1、PHLPP2，促進腫瘤細胞增殖和侵襲[24]。本研究結果顯示，胃癌組織miR-141相對表達量明顯低于癌旁正常組織；胃癌組織miR-141相對表達量與腫瘤直徑、組織分化程度、TNM分期有關，與患者性別、年齡、浸潤深度、遠處轉移無關。以上結果表明，miR-141在胃癌的發生、發展過程中具有抑癌作用，并且其表達下調與腫瘤的惡性進展密切相關。本研究結果還發現，miR-141低表達者術后生存時間和術后5年生存率均明顯低于miR-141高表達者，表明miR-141同樣有可能作為胃癌預后判斷的生物標志物。

本研究結果還發現，胃癌組織lncRNA H19相對表達量與miR-141相對表達量呈負相關關系，提示lncRNA H19與miR-141可能存在相互調控關系，共同影響胃癌的發生、發展。但lncRNA H19與miR-141如何共同調控胃癌的發生、發展尚不清楚，有待于進一步研究。

綜上所述，胃癌組織lncRNA H19高表達、miR-141低表達，二者表達呈負相關關系；胃癌組織lncRNA H19、miR-141表達與腫瘤的發生、發展有關，有可能成為胃癌診斷和預后判斷的潛在生物標志物。但由于本研究樣本量相對較少、隨訪時間相對較短，結果可能存在偏倚，今后需擴大樣本量、增加隨訪時間進一步驗證。