胃腺癌組織lncRNA HOTAIR、MEG3表達變化及其臨床意義

張曉玲，艾尼娃兒·巴巴依，王小云

(1 無錫市中醫醫院，江蘇無錫214100；2 新疆維吾爾自治區人民醫院；3 無錫市第二人民醫院)

每年全球大約新發胃癌患者100萬例，死亡約80萬例，是東亞、東歐以及中美洲和南美洲部分地區最常見的消化系統惡性腫瘤[1]。胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，其組織學類型主要有腺癌、鱗癌、鱗腺癌、未分化癌，以腺癌最為常見。手術切除是目前惟一有可能治愈胃癌的手段。胃癌早期采取根治性手術治療效果較好，術后5年生存率可達到90%。但由于早期癥狀不明顯，多數患者確診時已屬中晚期并伴有相鄰臟器、淋巴結的廣泛侵襲或遠處轉移，手術治療效果不佳，術后5年生存率較低[2]。分子靶向治療是近年新興的一種治療方法，是在細胞分子水平上針對已明確的致癌位點設計相應的治療藥物，從而精準殺死靶區內腫瘤細胞。因此，深入探索胃癌發生、發展的分子機制，對尋找腫瘤診斷標志物和治療靶點具有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的RNA調控分子，可作為染色質修飾因子對靶基因進行表觀遺傳學修飾，從而在轉錄或轉錄后水平對靶基因進行表達調控。近年研究發現，lncRNA還參與腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移等生物學過程[3]。HOX轉錄反義RNA(HOTAIR)是2007年由Howard Chang首次發現的lncRNA，長度約2.2 kb，定位于人染色體12q13.13，由哺乳動物HOXC基因簇轉錄而來[4]。有研究發現，肺癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤組織lncRNA HOTAIR異常表達，且其表達變化與腫瘤惡性進展有關[5]。母系印記表達基因3(MEG3)是小鼠母系印記基因Gtl2的人類同系物，是只在母源等位基因上表達的印記基因，長度約35 kb，定位于人染色體14q32.3，由10個外顯子組成。有研究發現，在多種腫瘤細胞中lncRNA MEG3低表達或表達缺失，恢復其表達則能抑制腫瘤細胞增殖并誘導其凋亡[6]。本研究觀察了胃腺癌組織lncRNA HOTAIR、MEG3表達變化及其臨床意義。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年5月～2018年10月無錫市中醫醫院收治的初診胃腺癌患者142例。所有患者經術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①符合胃腺癌診斷；②接受胃癌切除手術；③初診，術前未接受任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并嚴重肝、腎等重要臟器功能不全者；③有精神系統、自身免疫系統疾病者；④臨床病理資料不完整者。其中，男75例、女67例，年齡18～70(59.1±8．7)歲；腫瘤直徑：<5 cm 78例，≥5 cm 64例；腫瘤部位：賁門胃底部26例，胃體部24例，幽門胃竇部92例；組織分化程度：高中分化65例，低未分化77例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期84例，Ⅲ、Ⅳ期58例；有淋巴結轉移64例，無淋巴結轉移78例。本研究經無錫市中醫醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2 lncRNA HOTAIR、MEG3表達檢測 采用RT-qPCR法。將手術切除的胃腺癌組織及其配對的癌旁正常組織(距腫瘤組織邊緣>5 cm)置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱保存。取凍存的胃腺癌組織與癌旁正常組織約100 mg，室溫下解凍，采用TRIzol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。按逆轉錄試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，按2×SYBR Green PCR Master Mix說明進行PCR擴增。引物序列：lncRNA HOTAIR上游引物5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游引物5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；lncRNA MEG3上游引物5′-CTGCCCATCTACACCTCACG-3′，下游引物5′-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3′；GAPDH上游引物5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′，下游引物5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′。PCR反應體系共20 μL：cDNA模板2 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，無核酸水7.2 μL；反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40個循環。以GAPDH內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 胃腺癌組織與癌旁正常組織lncRNA HOTAIR、MEG3表達比較 胃腺癌組織與癌旁正常組織lncRNA HOTAIR相對表達量分別為4.12±0.54、0.32±0.07，lncRNA MEG3相對表達量分別為0.45±0.13、1.17±0.24。胃腺癌組織lncRNA HOTAIR相對表達量明顯高于癌旁正常組織，lncRNA MEG3相對表達量明顯低于癌旁正常組織(P均<0.01)。

2.2 胃腺癌組織lncRNA HOTAIR表達與lncRNA MEG3表達的關系 Pearson相關分析顯示，胃腺癌組織lncRNA HOTAIR相對表達量與lncRNA MEG3相對表達量呈負相關關系(r=-0.626，P<0.01)。

2.3 胃腺癌組織lncRNA HOTAIR、MEG3表達與患者臨床病理特征的關系 胃腺癌組織lncRNA HOTAIR、MEG3相對表達量均與腫瘤組織分化程度、TNM分期有關(P均<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位以及淋巴結轉移無關(P均>0.05)。見表1。

表1 胃腺癌組織lncRNA HOTAIR、MEG3表達與患者臨床病理特征的關系

3 討論

胃癌是我國最常見的消化系統惡性腫瘤，每年新發病例數和死亡例數分別占全世界的42.6%、45.0%[7]。手術切除是目前惟一有可能治愈胃癌的手段。胃癌早期采取根治性手術治療效果較好。但多數患者確診時已屬中晚期，手術治療效果不佳。分子靶向治療是近年興起的一種治療中晚期胃癌的重要手段，其治療的關鍵在于靶點定位的準確性。因此，深入探索胃癌發生、發展的分子機制，從而定位分子治療靶點，對提高治療效果具有重要意義。

近年研究表明，非編碼RNA(ncRNA)可通過影響染色質重塑、轉錄、轉錄后修飾和信號轉導調節等影響腫瘤的發生、發展[8]。根據核苷酸長度，可將ncRNA分為小RNA(≤200 nt)和lncRNA(>200 nt)。由于lncRNA缺少開放閱讀框架，其外顯子少，表達水平低于蛋白質編碼基因，但其表達具有較高的組織特異性。在功能上，lncRNA可作為分子支架、分子向導或染色質修飾因子等對靶基因表達進行調節，繼而調控細胞周期、細胞分化、基因轉錄和翻譯等。HOTAIR最初是在人成纖維細胞的HOX基因中被發現的，是一種具有反式作用的lncRNA，即可通過反式作用沉默染色質中基因表達。近年研究發現，lncRNA HOTAIR能與多梳抑制復合物2相互作用，導致H3K27三甲基化酶(PRC2復合體)功能喪失，從而抑制下游基因表達，繼而促進腫瘤細胞浸潤和遷移等惡性生物學行為；而在敲除lncRNA HOTAIR表達后，腫瘤細胞增殖、浸潤和遷移能力均下降[9]。有研究還發現，胃腸道腫瘤組織lncRNA HOTAIR高表達者多伴有淋巴結轉移和血行轉移，總體生存時間較短，故lncRNA HOTAIR有可能作為評估患者預后的分子生物標志物[10]。本研究結果發現，胃腺癌組織lncRNA HOTAIR相對表達量明顯高于癌旁正常組織，與以往研究[11，12]結果一致。表明lncRNA HOTAIR可能參與胃腺癌的發生、發展。進一步研究發現，胃腺癌組織lncRNA HOTAIR相對表達量與腫瘤組織分化程度、TNM分期有關，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位以及淋巴結轉移無關。表明胃腺癌組織lncRNA HOTAIR表達變化與腫瘤惡性進展有關。目前認為，lncRNA HOTAIR可通過5′端結合EED、EZH形成具有H3K27三甲基化能力的PRC2復合體，在3′端形成具有H3K4去甲基化能力的LSD1/CoREST/REST復合體，進而對染色質進行甲基化和去甲基化修飾，影響下游靶基因表達，如MMPs、PTEN等，從而促進腫瘤細胞增殖、浸潤和遷移[13]。

lncRNA MEG3最早是作為小鼠Gtl2的同源印記基因被發現的，在垂體和腦組織中表達較高，而在多種腫瘤組織中低表達。有研究表明，lncRNA MEG3表達降低與其編碼基因的差異性甲基化區域異常甲基化有關。lncRNA MEG3表達降低后，腫瘤細胞的浸潤和遷移能力增強，而通過質粒轉染使lncRNA MEG3過表達后，腫瘤細胞的增殖能力明顯受到抑制[14]，這表明lncRNA MEG3在腫瘤侵襲和轉移過程中具有重要作用。此外，lncRNA MEG3低表達者易出現淋巴結或血行轉移，且與患者較短的生存時間有關[15]。本研究結果發現，胃腺癌組織lncRNA MEG3相對表達量明顯低于癌旁正常組織，其原因可能與lncRNA MEG3的高甲基化有關。lncRNA MEG3定位于14號染色體的DLK1-MEG3印記基因區域，而DLK1-MEG3區域在父本等位基因上有兩個關鍵的甲基化區域，均位于轉錄起始位點的上游[16]，當該區域高甲基化時，lncRNA MEG3表達降低。進一步研究發現，胃腺癌組織lncRNA MEG3相對表達量與腫瘤組織分化程度、TNM分期有關，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位以及淋巴結轉移無關。表明lncRNA MEG3亦可參與胃腺癌的發生、發展，與以往文獻[17]報道一致。lncRNA MEG3可通過RNA-蛋白質相互作用直接激活腫瘤抑制因子RB1，或通過激活CDKN4A間接激活RB1，進而抑制腫瘤的發生、發展[18]。此外，lncRNA MEG3還能通過磷酸化等途徑抑制MDM2表達，當lncRNA MEG3表達降低時MDM2表達升高，其與p53蛋白結合，能夠抑制p53蛋白的反式激活和轉錄功能，從而促進腫瘤進展[19]。本研究還發現，胃腺癌組織lncRNA HOTAIR相對表達量與lncRNA MEG3相對表達量呈負相關關系，其原因尚不完全清楚，可能是lncRNA HOTAIR表達升高后，與EZH2、EED、SUZ12等因子結合形成具有甲基化酶功能的復合物，對染色質進行表觀遺傳學修飾，能夠抑制lncRNA MEG3表達[20]。

綜上所述，胃腺癌組織lncRNA HOTAIR表達升高、lncRNA MEG3表達降低，二者均參與胃腺癌的發生、發展。lncRNA HOTAIR、MEG3有可能成為胃腺癌診斷的分子生物標志物和潛在的治療靶點。