類風濕性關節炎患者外周血Nod樣受體蛋白3炎癥小體和白細胞介素1β表達*

陸光輝， 褚志華**， 曾守逵， 李春美， 楊潔， 游浩

(1.湖北民族大學附屬民大醫院 檢驗科， 湖北 恩施 445000； 2.江漢大學第一附屬醫院， 湖北 武漢 430000)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)以全身性炎癥及骨膜炎為主要臨床表現，血清學檢查時可查出自身抗體[1]。目前，RA病因及發生機制尚未完全清楚，有研究指出，各種炎癥介質和細胞因子直接或間接參與了RA發生及進展過程[2]。Nod樣受體蛋白3(nod-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)炎癥小體作為NOD樣受體分子，由NLRP3、半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)和凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)組成，在機體固有免疫應答及非感染性炎癥反應中發揮重要作用[3]，它能夠通過調控Caspase-1活化而促進白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)成熟分泌；此外，IL-1β作為一種促炎介質，在自身炎癥性疾病發生及進展中起著關鍵性作用[4]。本研究通過分析RA患者外周血中NLRP3炎癥小體和IL-1β表達變化，探討其在RA病情評估及診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 資料

選取2015年2月～2016年8月就診的RA患者106例作為RA組，男34例、女72例，30～72歲、均(60.68±12.34)歲，所有患者均符合美國風濕病學學會/歐洲抗風濕病聯盟(ACR/EULAR)關于RA診斷標準，排除心肝腎等重要臟器嚴重功能不全、惡性腫瘤、急慢性感染、其他自身免疫性疾病及結締組織病、以及孕婦或哺乳期婦女。選取同期骨性關節炎患者40例作為非RA組，男15例、女25例，32～74歲、平均(62.84±11.87)歲，均符合骨性關節炎相關診斷標準，排除標準同RA。選取健康體檢者60例作為對照組，男24例、女36例，29～71歲、平均(58.90±8.99)歲。本研究通過醫院倫理委員會批準(醫院倫理委員會批號JYK201408160328)，所有研究對象均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1血標本采集 RA組與非RA組于入院后第2天清晨、對照組于體檢當日清晨采集空腹靜脈血10 mL，分裝于EDTA抗凝血管和常規管內各5 mL。利用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，PBS沖洗后，保存于-80 ℃冰箱，用于檢測NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA表達；常規管內外周血離心后分離血清，保存于-80 ℃冰箱，用于檢測IL-1β。

1.2.2NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA表達 采用實時熒光定量PCR技術檢測，細胞裂解液裂解細胞，按Trizol總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)說明提取總RNA，利用紫外分光光度計(UV759S，購自上海精密儀器儀表公司)檢測總RNA純度，A260/A280為1.80～2.20。使用實時熒光定量PCR儀(StepOnePlus，購自美國ABI公司)按逆轉錄試劑盒(購自美國Promega公司)操作步驟將總RNA逆轉錄為cDNA，按PCR試劑盒(美國Promega公司)說明對引物擴增。NLRP3、Caspase-1、ASC及GAPDH(內對照)引物序列及產物大小見表1。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s循環38次。用2-△△Ct法計算外周血單個核細胞中NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA相對表達量。

1.2.3血清IL-1β水平 采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測，試劑盒購自自南京建成生物研究所，所有操作均按試劑盒說明在標準實驗室完成。

1.2.4RA患者病情指標 記錄反映RA患者病情的臨床評估指標，包括C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimen-tation rate，ESR)、抗環瓜氨酸肽(anti-cyclic citrullinated peptide，CCP)抗體和類風濕因子(rheumatoid factor，RF)水平。根據文獻[5]計算疾病活動性積分(disease activity score 28，DAS28)，按DAS28評分大小將RA患者分為低活動期(<3.2分)、中活動期(3.2～5.1分)和高度活動期(≥5.1分)[6]，比較不同活動期RA患者外周血單個核細胞中NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA相對表達量及血清IL-1β水平。采用Pearson相關分析RA患者外周血單個核細胞中NLRP3及血清IL-1β水平與其他臨床指標相關性，采用多元線性回歸分析DAS28評分影響因素。

表1 NLRP3、Caspase-1、ASC及GAPDH引物序列及產物大小Tab.1 Sequence and Product size of NLRP3,Caspase-1,ASC and GAPDH primers

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 一般資料

3組研究對象的年齡和性別比較差異無統計學意義(P>0.05)；RA組患者的CRP、ESR、CCP和RF均高于非RA組和對照組，非RA組患者 CRP和ESR高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組研究對象一般資料比較Tab.2 Comparison of general information of subjects in each group

(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與非RA組比較，P<0.05

2.2 外周血NLRP3、Caspase-1 和ASC mRNA相對表達量及血清IL-1β水平

RA組患者外周血單個核細胞中NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA相對表達量和血清IL-1β水平高于非RA組和對照組，非RA組高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

組別nmRNA相對表達量NLRP3 Caspase-1 ASCIL-1β(ng/L)RA組1062.05±0.29(1)(2)1.84±0.17(1)(2)1.72±0.24(1)(2)10.31±2.07(1)(2)非RA組401.54±0.12(1)1.47±0.12(1)1.30±0.09(1)6.11±1.13(1)對照組601.04±0.071.05±0.041.02±0.052.14±0.80 F426.982 645.750 302.157 493.982 P0.0000.0000.0000.000

(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與非RA組比較，P<0.05

2.3 不同分期RA患者外周血單個核細胞中NLRP3、Caspase-1和ASC mRNA相對表達量和血清IL-1β水平

高度活動期RA組患者外周血單個核細胞中NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA相對表達量和血清IL-1β水平均高于中活動期和低活動期，中活動期又高于低活動期，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

組別nmRNA相對表達量NLRP3 Caspase-1ASCIL-1β(ng/L)高度活動期282.43±0.10(1)(2)2.05±0.14(1)(2)2.00±0.12(1)(2)12.32±1.53(1)(2)中活動期372.09±0.13(1)1.81±0.08(1)1.79±0.10(1)10.95±1.42(1)低活動期411.76±0.081.71±0.071.47±0.108.37±0.86 F361.249 105.773 223.079 87.805 P0.0000.0000.0000.000

(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與非RA組比較，P<0.05

2.4 RA組患者外周血單個核細胞中NLRP3表達和血清IL-1β水平與其他臨床指標的相關性

相關分析顯示，RA組患者外周血單個核細胞中NLRP3表達量和血清IL-1β水平均與Caspase-1 mRNA、ASCmRNA、CRP、ESR、RF和DAS28評分呈正相關(P<0.05)，見表5。

表5 RA組患者外周血單個核細胞中NLRP3表達和血清IL-1β水平與其他臨床指標相關性(r，n=106) Tab.5 Correlation between the expression of NLRP3 and serum level of IL-1β in peripheral blood mononuclear cells of RA patients and other clinical indicators

注：(1)P<0.05

2.5 RA組患者DAS28評分影響因素分析

以DAS28評分為因變量，以RA組患者的年齡、CRP、ESR、CCP、RF、NLRP3 Mrna相對表達量、Caspase-1 mRNA相對表達量、ASCmRNA相對表達量和血清IL-1β水平為自變量進行多元線性回歸分析，結果顯示，RA組患者的CRP、RF和NLRP3 mRNA表達量是其DAS28評分的影響因素(P<0.05)，見表6。

表6 RA組患者DAS28評分影響因素的多元線性回歸分析Tab.6 Multiple linear regression analyze on influencing factors of DAS28 score of RA patients

3 討論

RA作為女性高發的一種自身免疫性疾病，可破壞關節及周圍組織，損傷關節功能，具有較高的致殘率，若早期未進行規范化治療，3年內70 %左右的患者會出現關節受損[7]，嚴重影響了患者生活質量。既往研究發現，免疫炎癥反應在RA發病過程中起著關鍵性作用，細胞因子參與及介導了RA滑膜病變過程[8-9]。NLRP3炎癥小體是炎癥反應的核心，與多種疾病發生及進展密切相關[10]，NLRP3、Caspase-1和ASC是NLRP3炎癥小體主要組成成分，NLRP3主要存在于單核巨噬細胞、嗜中性粒細胞及一些初級免疫細胞的細胞質和細胞膜中[11-12]。正常情況下，NLRP3炎癥小體以非活性狀態存在于機體，一旦受到病原微生物或機體內危險信號刺激時迅速活化，通過調控Caspase-1活性對IL-1β等炎癥因子前體進行切割，促使其成熟并釋放至胞外，從而引發炎癥級聯反應[13-14]。本研究結果顯示，RA組外周血單個核細胞中NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA相對表達量和血清IL-1β水平均高于非RA組和對照組，提示NLRP3炎癥小體介導的炎癥反應可能參與了RA發病過程。

CRP和ESR是反映自身免疫性疾病活動性重要指標，CCP和RF則是RA主要臨床診斷指標[15]。本研究結果顯示，RA組CRP、ESR、CCP和RF高于非RA組和對照組，相關分析顯示RA患者外周血單個核細胞中NLRP3表達量和血清IL-1β水平均與Caspase-1、ASC、CRP、ESR和RF呈正相關，提示RA患者外周血單個核細胞中NLRP3 mRNA表達量和血清IL-1β水平與患者活動性有關，提示這兩個指標有望成為RA診斷指標。DAS28作為評價RA病情的重要指標，評分越高則病情越嚴重[16]。本研究結果顯示，高度活動期RA患者外周血單個核細胞中NLRP3、Caspase-1和ASCmRNA相對表達量和血清IL-1β水平均高于中活動期和低活動期，中活動期高于低活動期，說明NLRP3炎癥小體通路介導的炎癥反應與RA病情密切相關，參與了患者病情進展過程。此外，RA組患者外周血單個核細胞中NLRP3 mRNA相對表達量和血清IL-1β水平均與DAS28評分呈正相關，NLRP3 mRNA表達量是DAS28評分的影響因素之一，提示RA患者外周血單個核細胞中NLRP3 mRNA表達量和血清IL-1β水平可作為評估患者病情的指標。

綜上所述，RA患者外周血單個核細胞中NLRP3 mRNA表達量和血清IL-1β水平升高，且與患者病情嚴重程度有關，提示NLRP3炎癥小體通路介導的炎癥反應參與了RA發生進展過程，有望為RA診斷及病情評估提供新的指標。