FAM134B在肝癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系

袁 野，馬丹丹，張建新，鐘藍海，蕭正康，張智勇

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)簡稱肝癌，是高度惡性的腫瘤[1]。據國際癌癥研究機構統計，肝癌發病率在全球位居男性癌癥第5位，女性癌癥第7位，死亡率在癌癥相關死因中位列第三[2-3]。肝癌5年生存率在過去10年沒有顯著提升，僅為10%[4]。大量增殖和侵襲轉移是肝癌患者病死率高及臨床療效差的關鍵，機制不明[5-6]。因此，探究肝癌發生發展機制對改善預后以及尋找肝癌診療靶點至關重要。Tang et al[7]報道134序列相似的家庭成員B (family with sequence similarity 134, member B, FAM134B)最早在食管鱗狀上皮癌中被發現，且與該腫瘤惡性表型有關。但關于FAM134B在肝癌中的作用和機制研究未見報道。該研究將以肝癌臨床標本及相應病例資料為基礎，探討FAM134B在肝癌中的表達及臨床意義，以期為尋找肝癌新的臨床診療靶點提供依據。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2016年1月～2017年12月在中國人民解放軍中部戰區總醫院接受手術治療的42例肝癌患者的組織標本及臨床病理資料。本研究獲得該院倫理委員會批準，患者及家屬均簽署知情同意書。手術切除病變肝癌組織標本及癌旁組織標本后，立即置入液氮中保存。42例患者的臨床病理資料包括：性別、年齡、腫瘤數目、乙肝、肝硬化、血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、腫瘤大小、腫瘤包膜完整情況、衛星灶、鄰近組織侵犯、門靜脈癌栓、肝外轉移、Child分級、BCLC分期等。

1.2 主要試劑FAM134B和GAPDH一抗及二抗均購自英國Abcam公司；TRIzol試劑盒、逆轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購自大連TaKaRa生物技術有限公司；總蛋白抽提試劑盒、蛋白濃度檢測試劑盒均購自美國Invitrogen公司；細胞培養基、血清、胰酶均購自日本Sigma公司；免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物公司；HepG2細胞與L02細胞均保存于本院中心實驗室液氮罐。

1.3 Real-time PCR檢測FAM134B mRNA表達運用TRIzol試劑盒提取mRNA、逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄成cDNA，低溫保存備用。Real-time PCR總反應體系為20 μl，其中SYBR Green mix緩沖液10 μl，上下游引物各0.6 μl(濃度為10 μmol/L)，cDNA 2 μl。反應條件為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環。FAM134B與GAPDH引物見表1。

表1 Real-time PCR引物的基因序列

1.4 免疫組織化學染色及結果判定免疫組織化學染色按試劑盒實驗步驟操作，制作石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，抗原修復，FAM134B抗體(1 ∶1 000稀釋)孵育，二氨基聯苯氨(DAB)顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片固定。免疫組織化學染色結果判定標準：未見陽性細胞或陽性細胞率<5%判定為陰性(-)，陽性細胞率5%～25%定為弱陽性(+)，25%～50%為中度陽性()，>50%為強陽性()。中度陽性及強陽性均判定為陽性表達。

1.5 Western blot檢測FAM134B蛋白表達肝癌組織和癌旁組織分別稱重并切成小塊置于EP管(eppendorf管)中，EP管中加入含蛋白酶抑制劑的蛋白質抽提試劑，反復研磨組織，冰上裂解30 min，使組織盡可能完全裂解，得到裂解液；小心刮下L02細胞及HepG2細胞，并轉移至EP管中，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白質抽提試劑，得到裂解液。將裂解液離心取上清液即得到蛋白樣品。二喹啉甲酸(BCA )法測定蛋白濃度。根據目的蛋白的分子量選擇相應的分離膠和濃縮膠，以恒定電壓80 V行SDS-PAGE電泳分離。蛋白電轉移至PVDF膜，FAM134B及GAPDH孵育一抗(1 ∶1 000稀釋)，4 ℃過夜，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。孵育二抗 (1 ∶3 000稀釋), 室溫搖床1 h，再次TBST洗膜3次，每次10 min.化學發光法曝光檢測。免疫印跡條帶的灰度值經灰度掃描儀分析后獲得。

2 結果

2.1 IHC檢測FAM134B蛋白表達FAM134B在42例肝癌組織及癌旁組織均有表達，詳見圖1。依據判定標準，FAM134B在癌旁組織中為陰性、弱陽性或中度陽性，但在肝癌組織中為弱陽性、中度陽性或強陽性。經統計得FAM134B在肝癌組織及癌旁組織陽性表達率分別為83%(35/42)和33%(14/42)，差異有統計學意義(χ2=12.343，P<0.05)。

圖1 FAM134B在癌旁組織及肝癌組織中的表達 DAB染色×200 A:癌旁組織；B:肝癌組織

2.2 Real-time PCR檢測FAM134B基因表達結果FAM134B在肝癌組織中的mRNA表達高于癌旁組織(t=22.084,P<0.05)。并且FAM134B在HepG2細胞中的mRNA表達高于L02細胞(t=19.985,P<0.05)，見圖2。

圖2 Real-time PCR檢測FAM134B的mRNA表達

與癌旁組織比較：*P<0.05；與L02細胞比較：#P<0.05

2.3 Western blot檢測FAM134B蛋白表達結果FAM134B蛋白在HepG2細胞中的表達高于L02細胞，FAM134B在肝癌組織中的蛋白表達同樣低于癌旁組織。見圖3。

圖3 Western blot檢測FAM134B的蛋白表達

2.4 FAM134B蛋白表達水平與肝癌臨床病理特征之間的關系FAM134B蛋白表達量與腫瘤大小(t=1.089，P<0.05)、血清AFP(t=-7.273，P<0.05)、門靜脈癌栓(t=6.309，P<0.05)、肝外轉移(t=6.640，P<0.05)、鄰近器官侵犯(t=7.959，P<0.05)和分化程度(t=6.115，P<0.05)顯著相關，即FAM134B表達量增高時，腫瘤更大、AFP更高、鄰近器官侵犯更多、分化程度更低，且存在門靜脈癌栓和肝外轉移。然而與性別、年齡、乙肝、肝硬化、淋巴結侵犯無明顯相關性(P>0.05)。FAM134B在AFP表達水平正常的肝癌標本中部分(42.86%，12/28)高表達。見表2。

表2 FAM134B蛋白表達量與肝癌臨床病理特征之間的關系

3 討論

FAM134B是一個相對較新的分子，目前國內外關于FAM134B在人類疾病中的作用研究較少，2007年，Tang et al[7]發現FAM134B在食管鱗狀細胞癌中促進癌細胞生長和增殖，表現為癌基因的特性。相反在2014年，相關研究[8-9]顯示FAM134B在結腸癌中抑制癌細胞生長增殖和侵襲轉移，表現為抑癌基因的特性。FAM134B在不同的腫瘤中發揮不同的作用激發了筆者極大的研究興趣。鑒于FAM134B在肝癌中發揮的作用及機制研究目前是空白的，且研究[10-11]表明FAM134B突變與癌癥患者臨床病理特征密切相關。因此本研究致力于研究FAM134B與肝癌患者臨床病理特征的關系，探討其臨床意義。

癌癥是由信號通路中的促進細胞生長和增殖的原癌基因與調節細胞分裂和存活的抑癌基因失調而發展的細胞疾病[12]，原癌基因的異常表達或抑癌基因被抑制將導致癌癥進展[13]。本研究中免疫組化檢測結果顯示FAM134B在肝癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織。Real-time PCR和Western blot檢測結果均顯示FAM134B在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，且在HepG2細胞中的表達顯著高于L02細胞。可見，FAM134B在肝癌中呈高表達，發揮癌基因特性。本研究結果與Tang et al[7]的報道一致，與Kasem et al[8]及Islam et al[9]的報道相反。

本研究通過統計分析FAM134B蛋白表達與42例肝癌患者臨床病理特征之間的關系得出：FAM134B在肝癌組織中高表達與肝癌患者的性別、年齡、乙肝、肝硬化與淋巴結侵犯無明顯相關。但FAM134B表達量增高時，腫瘤更大、AFP更高、鄰近器官侵犯更多、分化程度更低。且存在門靜脈癌栓和肝外轉移的患者FAM134B表達量更高。結果提示FAM134B可能在肝癌發生發展、侵襲轉移中發揮一定的促進作用。肝癌患者的預后與早發現、早診斷、早治療有直接關系[3]。目前，AFP有助于篩查和早期診斷肝癌[14]，但AFP也有其局限性，即只有40%～60%的肝癌患者AFP增高，尚有部分肝癌患者的血清AFP水平并沒有顯著升高。如果這部分肝癌患者僅用AFP這一生化檢測指標來篩查和早期診斷肝癌，則容易造成漏診。因此探索更多生物學指標來增強肝癌早期診斷的精確性、靈敏度和特異度具有較大的臨床意義。本研究中，FAM134B在AFP表達水平正常的肝癌標本中高表達，達42.86%。因此，本研究結果提示FAM134B可能是AFP陰性肝癌的潛在早期診斷指標。