食物過敏患兒臨床特點及血清IL-10、IL-2R、IL-8水平研究

盛 瑤，吳 成，李傳應

食物過敏根據免疫機制的不同，可分為IgE或非IgE型[1]。IgE介導食物過敏主要涉及Ⅰ型變態反應，非IgE介導的食物過敏主要涉及Ⅲ型變態反應和Ⅳ型變態反應(T細胞介導)[2]。目前普遍認為效應性T細胞(effector T cells，Teffs)中輔助性T細胞(helper T cell，TH)亞群TH1/TH2失衡、調節性T細胞(regulatory T cells，Tregs)功能紊亂是食物過敏重要分子機制之一。白細胞介素2(interleukin-2，IL-2)及其受體(interleukin-2 receptor，IL-2R)在調控Teffs及Tregs的功能中起到重要作用。IL-10主要由Tregs分泌，是一種免疫抑制因子，對食物過敏免疫耐受性至關重要[3-4]，目前上述細胞因子在不同免疫機制介導的食物過敏患兒體內變化特點尚無相關文獻報道[5]。該研究考察食物過敏患兒臨床特點及上述細胞因子水平，為進一步探究不同免疫途徑介導的食物過敏相關消化道疾病的免疫學機制提供有價值的線索。

1 材料與方法

1.1 病例資料選擇安徽省兒童醫院消化內科2017年12月～2018年6月臨床診斷為食物過敏患兒共52例為研究組，所有患兒通過飲食回避、母乳喂養患兒母親嚴格回避過敏食物或更換游離氨基酸配方粉后，食物過敏癥狀減輕或消失，再次進食該食物，食物過敏癥狀再次出現，即食物回避-激發試驗陽性[6]。另排除其他可引起消化道癥狀的原因，如先天性巨結腸、炎癥性腸病、麥克爾憩室等。根據患兒血清食物特異性IgE抗體水平高低，分為非IgE組(36例)及IgE組(16例)。同時選取2017年12月～2018年6月于安徽省兒童醫院體檢的15例健康兒童作為對照組。研究組與對照組在性別和年齡上差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。該研究已通過安徽醫科大學附屬省兒童醫院倫理委員會審批，并與患兒家長簽署知情同意書。

表1 食物過敏患兒與對照組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1血細胞學檢測 取研究組患兒及正常對照組兒童外周靜脈血2 ml加入肝素抗凝管中，測定全血細胞計數(complete blood count，CBC)與差分計數，以評估白細胞數(×109/L)、淋巴細胞數(×109/L)、嗜酸性粒細胞數(×109/L)、嗜酸性粒細胞比(%)、血紅蛋白(g/L)水平。

1.2.2細胞因子及受體檢測 使用西門子醫學診斷產品有限公司生產的IMMULITE 1000全自動化學發光免疫分析儀定量檢測研究組患兒及正常對照組兒童血清中細胞因子IL-10、IL-2R及IL-8水平(化學發光法)，具體操作步驟參照IMMULITE 1000操作手冊進行實驗前的準備、設置、稀釋、校準、測定和質控程序。

1.2.3外周血單核細胞制備及RNA提取 取實驗組患兒及正常對照組兒童外周靜脈血5 ml，肝素鈉抗凝，采用Ficoll密度梯度法分離血漿并提取外周血單核細胞，培養基重懸細胞，調整濃度為3×106個/ml。采用TRIzol法提取細胞總RNA，利用PrimeScriptTM逆轉錄試劑盒(日本TAKARA公司)合成cDNA。引物序列由TAKARA公司合成。IL-10序列信息： 5′-ACATCAAGGCGCATGTGAAC-3′,5′-TA GAGTCGCCACCCTGATGT-3′; IL-2R序列信息：5′-GACAGGCCACACAGATGCTA-3′, 5′-GCTGGGATTC ACTCAGTTTGT-3′; IL-8序列信息：5′-CCACCGGAAGGAACCATCTC-3′；5′-TTCCTTGGGGTCCAGACAGA-3′；GAPDH序列信息：5′-TTCAACGGCACAGTCAAG-3′, 5′-CCAGCATCACCCCATTT-3′。

1.2.4實時熒光定量PCR 使用SYBR?Premix Ex TaqTMII熒光定量試劑盒進行實時熒光定量PCR反應, 具體步驟按照說明書進行。利用Ct值計算目的基因的相對表達量：ΔΔCt=(Ct病例組-CtGAPDH)-(Ct對照組-CtGAPDH)。病例組目的基因mRNA相對表達量=2-ΔΔCt。

1.2.5血清總IgE抗體及食物特異性IgE抗體檢測 使用西門子醫學診斷產品有限公司生產的IMMULITE 2000 XPi全自動化學發光免疫分析儀定量檢測研究組患兒血清中總IgE水平(化學發光法)，具體步驟參照IMMULITE 2000操作手冊進行實驗前的準備、設置、稀釋、校準、測定和質控程序。采用歐蒙醫學實驗診斷股份公司生產的吸入性及食物性過敏原特異性IgE抗體檢測試劑盒(免疫印跡法)，在體外半定量檢測血清中特異性IgE抗體濃度。檢測項目：柳樹/楊樹/榆樹、普通豚草、艾蒿、屋塵螨/粉塵螨、屋塵、貓毛、狗上皮、蟑螂、點青霉/分枝孢霉/煙曲霉/交鏈孢霉、葎草、雞蛋白、牛奶、花生、黃豆、牛肉、羊肉、鱈魚/龍蝦/扇貝、蝦、蟹。

2 結果

2.1 臨床特征非IgE組和IgE組食物過敏患兒均以消化道癥狀及濕疹為主要臨床表現，其中非IgE組患兒出現較多的臨床癥狀為腹瀉(58.33%)、血便(33.33%)和濕疹(55.56%)；IgE組患兒出現較多的臨床癥狀為腹瀉(68.75%)和濕疹(62.50%)。經統計，非IgE組與IgE組患兒臨床癥狀發生率差異無統計學意義，見表2。

表2 非IgE組與IgE組食物過敏患兒臨床特征比較[n(%)]

*采用χ2檢驗，**采用校正χ2檢驗，#采用Fisher精確概率法

2.2 血細胞學分類與對照組比較，非IgE組與IgE組患兒血淋巴細胞計數及嗜酸性粒細胞計數均顯著高于對照組(P<0.05)，非IgE組與IgE組比較，淋巴細胞計數及嗜酸性粒細胞計數差異無統計學意義(P>0.05)，而白細胞計數、嗜酸性粒細胞比例及血紅蛋白計數非IgE組、IgE組與對照組兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3。

2.3 血清細胞因子及受體水平比較非IgE組患兒血清IL-10水平和外周血單個核細胞IL-10 mRNA水平顯著低于對照組和IgE組(P<0.05)，但IgE組IL-10血清水平和細胞mRNA水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。非IgE組和IgE組患兒血清IL-2R以及外周血單個核細胞IL-2R mRNA水平顯著高于對照組(P<0.05)，但非IgE組與IgE組IL-2R水平差異無統計學意義(P>0.05)。此外，非IgE組患兒血清IL-8水平和外周血單個核細胞IL-8 mRNA水平顯著高于對照組(P<0.05)，而IgE組患兒IL-8水平與對照組、非IgE組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4、圖1。

血細胞學分類非IgE組(n=36)IgE組(n=16)對照組(n=15)統計量值白細胞計數(×109/L)9.62±2.6510.13±3.058.40±2.731.637淋巴細胞計數(×109/L)5.73±2.24?5.47±1.84?3.73±1.895.065嗜酸性粒細胞計數(×109/L)0.47±0.44?0.45±0.28?0.21±0.162.911嗜酸性粒細胞比例(%)3.65(3.20)4.22(5.10)3.20(2.20)3.433血紅蛋白計數(g/L)118.39±61.60111.25±12.10109.80±14.830.241

與對照組比較：*P<0.05

細胞因子非IgE組(n=36)IgE組(n=16)對照組(n=15)統計量值IL-10(ng/L)3.47(1.38)??#9.20(2.14)14.00(13.61)45.024IL-2R(IU/L)2 048.58±495.79?1 772.50±888.11?1 112.00±364.3513.332IL-8(ng/L)22.30(49.70)?15.10(10.10)13.20(9.20)7.726

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與IgE組比較，#P<0.05

A：非IgE組、IgE組與對照組患兒外周血單個核細胞IL-10 mRNA水平；B：非IgE組、IgE組與對照組患兒外周血單個核細胞IL-2R mRNA水平；C：非IgE組、IgE組與對照組患兒外周血單個核細胞IL-8 mRNA水平；與對照組比較：#P<0.05,##P<0.01；與IgE組比較：*P<0.05

3 討論

研究[7-8]表明，IL-10血清濃度降低與食物過敏的高風險存在緊密聯系。牛奶蛋白過敏患兒游離氨基酸配方干預前血清IL-10水平比干預后顯著降低，提示牛奶蛋白過敏患兒體內IL-10水平異常。根據本研究結果顯示，非IgE介導的食物過敏中，Tregs活性降低，其分泌IL-10等免疫抑制因子水平較低，不足以調節炎癥反應，導致了口服免疫耐受缺陷，從而引起了一系列臨床癥狀，如腹瀉、血便等，而IgE介導的食物過敏主要涉及TH2型細胞因子如組胺、IL-4、腫瘤壞死因子α等為主導的I型變態反應，與Tregs活性及IL-10水平高低關系不大。本研究還顯示，IgE組患兒血清IL-10水平顯著高于非IgE組，推測與體液免疫應答中，IL-10能夠增強B細胞上II類表達并誘導免疫球蛋白的生成有關[9]。綜上考慮，檢測食物過敏患兒血清IL-10水平高低對于初步判斷食物過敏免疫類型具有一定的指向性意義。

IL-2結合IL-2R可激活三種不同的信號通路發揮作用[10]。IL-2與Teffs表面IL-2R結合可激活并誘導Teffs，并加強Teffs的殺傷作用(免疫激活)；IL-2與Tregs表面IL-2R結合是維持Tregs細胞存活及發揮作用的必要條件[11](維持免疫耐受)。本研究結果表明，IL-2和IL-2R信號通路在食物過敏中主要表現為免疫激活而非免疫耐受，推測與在IL-2R高表達條件下，Teffs處于高度活化狀態，可積極發揮免疫激活作用，而Tregs維持免疫耐受功能并不明顯有關，這與本研究中非IgE組患兒血清IL-10水平、IL-10 mRNA水平顯著低于對照組相一致。此外，食物過敏患兒血清IL-2R水平均顯著升高，表明檢測患兒血清IL-2R水平可作為快速明確食物過敏診斷的重要指標之一。

Kimura et al[12]對食物蛋白誘導的小腸結腸炎患兒血清細胞因子進行檢測發現，血清中IL-2、IL-5及IL-8水平顯著升高，提示IL-2、IL-5和IL-8參與了FPIES相關的免疫應答反應，這與本研究中非IgE組IL-8水平、IL-8 mRNA水平顯著高于對照組相一致。然而，IL-8是一種強中性粒細胞趨化因子，其可趨化中性粒細胞定向游走到病灶并釋放一系列炎癥活性因子，通常認為中性粒細胞浸潤是急性炎癥反應的特征之一，目前食物過敏發病機制雖尚未完全闡明，但國內外公認食物過敏是免疫介導的變態反應，故而食物過敏并不支持急性炎癥反應。因此，對于IL-8在食物過敏患兒血清水平的變化可能需要進一步研究闡明。