非小細胞肺癌組織及細胞中IL-35的表達

張 玉，張城城,2，董利菊，沙 泉

隨著惡性腫瘤發病率與死亡率的逐年增加，人類健康受到了嚴重威脅。肺癌已經成為男性發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。雖然肺癌的研究近年來已取得一定進展，但是非小細胞肺癌(non-small lung cancer,NSCLC)發現時多已處于中晚期，5年生存率并未顯著提高[2]。白細胞介素35(interleukin-35，IL-35)是新發現的白細胞介素12(interleukin-12，IL-12)家族成員，由EB病毒誘導基因3(epstein-barr virus-induced gene 3，EBI3)和P35組成的異源二聚體，主要在免疫細胞中表達[3]。研究[4-6]顯示，IL-35在肝癌、胰腺癌、結直腸癌等多種腫瘤組織中高表達，參與腫瘤的發生發展與轉移。但IL-35在NSCLC中的表達情況知之甚少。該研究擬通過分析IL-35在NSCLC中的表達和與患者預后的關系，以及對肺癌細胞生物學功能的影響，闡明IL-35在NSCLC發生、發展中的可能作用，為肺癌的靶向治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽醫科大學第一附屬醫院普胸外科2015年1～12月的74例NSCLC患者石蠟包埋的肺癌組織，被研究者臨床資料完整，手術前均未行放化療。NSCLC患者男47例，女27例；年齡43～84(61.31±8.49)歲，其中腺癌41例，非腺癌33例。根據國際肺癌TNM標準分期：T1+T2者55例，T3+T4者19例；淋巴結轉移：N0+N1者54例，N2+N3者20例：遠處轉移 M0者65例，M1者9例。選擇同期入院治療的肺部良性病變患者石蠟包埋的肺組織25例，設為對照組，男14例，女11例；年齡21～68(45.92±15.06)歲，其中肺大皰7例，硬化性血管瘤5例，錯構瘤4例，支氣管擴張4例，其他5例。

1.2 主要試劑免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；RNA提取試劑盒購自臺灣GeneMark生物公司；逆轉錄及SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購自南京Vazyme公司；人肺腺癌細胞株A549、NCI-H1975和PC-9為本單位免疫學省級重點學科實驗室保存；正常人腎上皮細胞HEK293由安徽醫科大學寄生蟲學教研室饋贈；DMEM細胞培養基購自以色列BI公司；胎牛血清購自杭州四季青生物公司；Transwell小室購自美國Corning公司；CCK-8購自上海貝博生物公司；IL-35的亞基EBI3和P35抗體購自美國Abcam公司；人重組IL-35蛋白購自美國PeproTech公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化法檢測IL-35兩個亞基在NSCLC組織中的表達 采用SP法，以PBS代替一抗作陰性對照。首先組織切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精(100%、95%、75%)水化。檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)于高壓鍋中加熱煮沸，放入切片，蓋上壓力氣閥至噴氣后1～3 min進行抗原修復，3% H2O2孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶活性。PBS沖洗，然后一抗4 ℃孵育過夜，PBS沖洗，二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色沖洗。最后蘇木精復染，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片，鏡檢并拍照記錄。免疫組化結果判斷：本實驗采用許良中 等[7]的方法，根據細胞著色程度和陽性細胞占觀察細胞百分比的評分乘積進行半定量。隨機選取5個400倍視野，每個視野計數100個細胞，按著色程度評分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細胞占觀察細胞百分比評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項得分結果相乘：0～2分為陰性(-)，3～5分為弱陽性(+)，6～8分為中度陽性()，>8分為強陽性()。其中-定義為蛋白陰性，+～定義為蛋白陽性。

1.3.2細胞培養與傳代 細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，于37 ℃、5%CO2、相對濕度90%的培養箱中培養，隔天換液，顯微鏡下觀察細胞形態，若為單層緊密狀態時，用EDTA-胰蛋白酶消化，收集對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.3.3RT-PCR法檢測細胞中IL-35亞基表達水平 分別收集對數生長期的A549、NCI-H1975、PC-9和HEK293細胞，提取總RNA作為模板并逆轉錄生成cDNA進行RT-PCR。EBI3：上游引物：5′-CCTTCATTGCCACGTACAGG-3′，下游引物：5′-GGGCTTGATGATGTGCTCTG-3′，擴增長度為206 bp；P35：上游引物： 5′-TCAGAATTCGGGCAGTGACT-3′，下游引物： 5′-AGTCCCATCCTTCTTTCCCC-3′，擴增長度為163 bp。內參為β-actin,PCR反應預變性溫度：95 ℃、5 min,1個循環。循環反應溫度:95 ℃,10 s;60 ℃,30 s,40個循環。溶解曲線溫度:95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s，1個循環。

1.3.4CCK-8法檢測細胞增殖能力 取對數生長期的A549細胞，計數細胞：每100 μl細胞數為2 000～5 000個，加入到96孔板中，待細胞貼壁，分別用2、10、50 ng/ml的IL-35刺激48 h后，每孔中加入10 μl CCK-8溶液，繼續培養1～4 h，于酶標儀450 nm 波長處測吸光度(A)值。

1.3.5劃痕實驗和Transwell小室測細胞遷移侵襲能力 劃痕實驗：取對數生長期的A549細胞，胰酶消化，在6孔板中加入5×105個細胞，37 ℃培養過夜。用無菌槍頭緩慢劃痕，用PBS清洗細胞2～3次去除浮起的細胞。對照組加入含0.5%血清的DMEM培養基，IL-35組在加入含0.5%血清的DMEM培養基的同時,加入50 ng/ml的IL-35,放入37 ℃培養，按0、12、24 h取樣，拍照。Transwell實驗：A549細胞用50 ng/ml的IL-35刺激24 h后，胰酶消化制成5×105個/ml的細胞懸液。在小室上層加入20 μl Matrigel覆蓋整個聚碳酸酯膜后自然晾干。下層加入含10%血清的DMEM培養基600 μl,上層加入200 μl不含血清的A549細胞懸液，37 ℃繼續培養24 h,多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色15～20 min，顯微鏡下拍照計數。

圖1 NSCLC和肺部良性病變組織中EBI3和P35的表達

2 結果

2.1 IL-35在NSCLC組織中的表達免疫組化連續切片法染色結果顯示，NSCLC組織中EBI3和P35的表達水平明顯高于肺部良性病變者(圖1)，且EBI3和P35在空間分布和表達水平上有很強的相關性(rs=0.770,P<0.001)，見表1，所以這兩者的表達可以代表IL-35的表達水平，將IL-35表達定義為EBI3和P35都為(/)，其余情況為IL-35不表達。免疫組化結果表明NSCLC組織中可能高表達IL-35。統計分析顯示，IL-35表達與腫瘤T分期(χ2=5.129，P<0.05)、淋巴結轉移(χ2=8.761，P<0.01)呈正相關性，與患者性別(χ2=0.667，P>0.05)、年齡(χ2=0.746，P>0.05)、組織類型(χ2=1.66，P>0.05)、分化程度(χ2=0.688，P>0.05)及遠端轉移(P>0.05)等無相關性(表2)，以上結果提示：IL-35可能是肺癌的潛在標志物。

表1 IL-35兩個亞基在74例NSCLC中表達的相關性

*采用Spearman相關性分析

表2 IL-35表達與NSCLC病理特征的相關性(n)

2.2 IL-35亞基在肺癌細胞和HEK293中的表達以人腎上皮細胞HEK293為對照，通過RT-PCR法檢測IL-35亞基EBI3和P35在不同肺癌細胞系中的表達。結果顯示，IL-35亞基在肺癌細胞系A549、H9175、PC-9中的表達水平與人正常細胞HEK293細胞有差異(圖2)，表明IL-35可能在肺癌的進展中發揮重要作用。

圖2 EBI3和P35在不同肺癌細胞系和正常細胞中的表達

2.3 IL-35對A549肺癌細胞增殖的影響鑒于IL-35在A549細胞中表達量最高，且易培養，因此選擇A549細胞作為后續研究對象。不同濃度的人重組外源性IL-35蛋白作用于A549細胞48 h后，通過CCK-8法檢測顯示，50 ng/ml的IL-35可明顯促進A549肺癌細胞的增殖,與0 ng/ml比較，差異有統計學意義(P<0.001),見圖3。

圖3 不同濃度IL-35對A549細胞活力的影響

2.4 IL-35對A549細胞遷移和侵襲能力的影響采用劃痕實驗于0、12、24 h分別檢測50 ng/ml的IL-35對A549細胞遷移能力的影響，結果顯示，IL-35具有一定的促進肺癌細胞遷移的能力，與對照組比較，24 h后劃痕相對寬度明顯降低，差異有統計學意義(P<0.001)，見圖4A、4B。Transwell小室實驗結果顯示，IL-35具有一定的促進肺癌細胞侵襲的作用，與對照組比較，IL-35組侵襲細胞數量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4C、4D。由此可推測IL-35可明顯促進A549細胞的遷移和侵襲。

3 討論

肺癌是發病率和死亡率增長最快，對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。肺癌好發于支氣管黏膜上皮，病因至今尚不完全明確。隨著醫療水平的提高，肺癌的治療方法日益豐富，已發展成為手術為主，放療、化療和免疫治療等治療手段為輔的綜合性治療，但NSCLC確診時多已屬于晚期，總體預后情況仍不容樂觀[8-9]。隨著分子生物學的不斷發展，基因治療已成為腫瘤治療的研究熱點，而尋找有效的靶基因尤為重要。研究證實，白細胞介素能影響包括腫瘤細胞在內的多種細胞的增殖、成熟、黏附及轉移等多方面生理過程。大量動物實驗結果顯示，IL-12對肝癌、腎細胞癌等多種癌癥具有防治效果，可增強免疫應答，發揮抗腫瘤作用[10]。

IL-35是IL-12家族的最新成員，主要由Treg細胞分泌，在單核細胞、T細胞、B細胞及腫瘤細胞等多種類型細胞上表達，通過激活JAK-STAT信號通路參與免疫功能的調節，除了直接抑制腫瘤微環境的腫瘤免疫狀態，引起免疫逃逸，IL-35還能直接作用于某些腫瘤細胞促進腫瘤的進展[11]。Wang et al[12]研究發現，IL-35在B細胞淋巴瘤、黑色素瘤及鼻咽癌等多種腫瘤組織和腫瘤細胞系中都有表達。有研究[13]證實IL-35在急性髓系白血病中，除了能誘發腫瘤的免疫逃逸機制外，也能直接促進腫瘤增殖及抑制腫瘤凋亡。一項NSCLC研究[14]顯示，NSCLC患者血漿IL-35水平較正常對照人群明顯升高，且血漿IL-35高表達水平與較差的TNM分期及淋巴結轉移顯著相關，單因素及多因素分析顯示血漿IL-35是NSCLC患者的獨立預后因素。由此可見，IL-35可能在腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用。

圖4 IL-35對A549細胞遷移和侵襲的影響

A:顯微鏡下細胞遷移能力的差異×50；B：劃痕愈合的相對定量分析；與對照組比較：***P<0.001；C: 顯微鏡下細胞侵襲能力的差異×100；D：細胞侵襲數目的定量分析；與對照組比較：**P<0.01

本研究通過免疫組化法檢測NSCLC患者和對照組組織中IL-35的表達水平，結果顯示NSCLC患者組織中IL-35的表達明顯高于肺部良性病變患者，初步表明IL-35在NSCLC患者組織中異常高表達。通過統計分析74例NSCLC患者組織中IL-35表達差異與臨床病理特征之間的相關性得出：IL-35表達與腫瘤分期、淋巴結轉移呈正相關性, 與患者性別、年齡、組織類型、分化程度及遠端轉移等均無相關性，而復發和早期轉移是NSCLC預后不良的主要因素，說明IL-35的高表達水平和患者的不良預后相關，提示其可能影響NSCLC的發生、發展。接著通過體外細胞功能學實驗證實，人重組IL-35蛋白能明顯促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，表明IL-35在NSCLC中可能是一種新的促癌不良因子，參與肺癌的不良進程。因此，IL-35可以作為一個新的有效的治療靶點，應用于臨床和靶向藥物的研發。

綜上所述，IL-35在NSCLC中高表達，并促進肺癌細胞的增殖、遷移與侵襲，為深入研究IL-35對腫瘤的作用提供了線索，IL-35可能是一種NSCLC診斷和預后判斷的新型標志物，但是IL-35發揮促癌作用的具體分子機制仍待進一步研究。