苗藥四大血對膠原誘導性關節炎大鼠的作用研究

李欣芯，石光玉，陶 然，趙麗萍，黎曼英，吳 艷，馮有為，陳 勇，孫見飛，吳 寧

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)屬于一種自身免疫性疾病，累及人體許多組織與器官，并以對關節的破壞為主，患者呈全球性分布[1]。目前，關于RA的發病原因及機制尚不完全清楚，以消炎鎮痛、控制病情發展為主的臨床治療未有良好的療效。四大血由五花血藤、雞血藤、黑骨藤、見血飛四味藤本藥材組成，是苗族地區通氣散血的代表天然藥物。具有活血、舒筋、行瘀、止痛、祛濕之功，用于治療風濕關節疼痛、肢體麻木、跌打損傷、創傷出血等病癥[2-3]。該研究主要探究苗藥四大血用于膠原誘導性關節炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠的療效及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及主要儀器實驗動物：36只清潔級雄性SD大鼠，體質量180～220 g，于18～26 ℃,相對濕度40%～70%下飼養；雷公藤多苷購自黃石飛云制藥公司；牛II型膠原購自美國Chondrex公司；白介素-17(interleukin-17，IL-17)試劑盒購自深圳子科生物技術公司；水平電泳槽DYY-Ⅲ 31D購自北京六一儀器廠；Quanity One凝膠成像分析系統購自美國BIO-RAD公司；酶標儀購自美國BIO-TEK公司。

1.2 模型制備及動物分組將等體積的牛Ⅱ型膠原(4 mg/ml)與弗氏不完全佐劑在冰浴條件下充分乳化，在水中不散開即可使用(濃度為2 mg/ml)[4]。每只大鼠取0.2 ml在尾根及左足墊部皮下注射，空白組用等體積生理鹽水代替。1周后加強免疫一次。造模成功后，按10 ml/kg給予大鼠灌胃治療。四大血高、中、低劑量組藥物濃度分別為4、2、1 g/ml，陽性藥物組按40 g/kg灌胃雷公藤多苷片，空白組及模型組用等量生理鹽水代替。灌胃21 d。

1.3 大鼠足腫脹度及關節指數測定采用自制大鼠足部容積測量儀，于造模前1 d開始，每隔1周測量1次大鼠右足跖部體積。并于大鼠灌胃前、灌胃1周、灌胃2周、灌胃3周時采用5級評分法評價大鼠關節炎指數(arthritis index，AI)[5]。將未注射乳化劑的其它關節積分累計起來，即為每只大鼠的評分，最高為12分，積分越高表示關節炎癥越嚴重。

1.4 滑膜組織切片觀察關節病理及核因子-κB p65(nuclear factor-kappa B p65，NF-κB p65)免疫組織化學觀察。取下大鼠膝關節滑膜立即用4%中性甲醛固定，固定24～48 h后放入EDTA溶液中脫鈣處理。經濃度梯度酒精脫水、二甲苯透明后石蠟包埋，分別進行常規HE染色及IHC染色觀察，NF-κB/p65稀釋度為1 ∶50。

1.5 IL-17含量檢測ELISA法測定大鼠血清IL-17：將取出的全血室溫靜置20 min，3 000 r/min 離心15 min，取血清按ELISA試劑盒操作檢測IL-17含量，并根據450 nm處測定的光密度(optical density，OD)值繪制曲線并計算各樣本濃度。

1.6 蛋白免疫印跡檢測Western bot法檢測NF-κB p65、核因子κB抑制蛋白α(NF-Kappa-B inhibitor alpha，IκB-α)含量：按每孔40 μg總蛋白量上樣于12% SDS-PAGE膠上電泳分離，后轉印至PVDF膜，室溫振蕩封閉2 h。將一抗稀釋(IκB-α為1 ∶1 000，NF- κB p65為1 ∶1 500)后與膜4 ℃反應過夜；TBST漂洗10 min×3次，后加入適當稀釋的二抗工作液室溫搖動1 h，TBST漂洗10 min×3次；曝光并分析其灰度值。

2 結果

2.1 大鼠足部腫脹度觀察造模前各組大鼠右足跖體積無差異。而在灌胃前，各實驗組與空白組大鼠右足跖體積有顯著差異。灌胃治療3周后，四大血高、中、低劑量組以及陽性藥物組均能抑制大鼠足腫脹，差異有統計學意義(F=7.681，P<0.05)。見表1。

2.2 大鼠AI評分變化AI 評分是評價 CIA 模型關節炎發病的客觀指標之一，各組大鼠AI評分可見表2。灌胃治療前，模型組的大鼠AI升高；灌胃治療兩周后，各組AI有所下降，但是除四大血高劑量組外差異均無統計學意義(P>0.05)，而在治療3周之后，四大血治療組的AI與模型組比較差異有統計學意義(F=28.715，P<0.01)。

2.3 大鼠血清IL-17含量變化大鼠血清IL-17含量變化見表3。模型組IL-17含量明顯高于空白組；四大血高、中劑量及陽性藥物組IL-17含量有明顯下降，與模型組比較，差異有統計學意義(F=4.74，P<0.05)；而四大血低劑量組與模型組無明顯差異，提示四大血低劑量組對CIA大鼠血清IL-17的影響較小。

表1 各組大鼠足部腫脹度變化

與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01；與陽性藥物組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01

表2 各組大鼠AI評分

與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01；與陽性藥物組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01

圖1 各組大鼠HE染色

表3 各組大鼠血清IL-17含量變化

與空白組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01；與陽性藥物組比較：▲▲P<0.01

2.4 大鼠滑膜組織病理切片觀察空白組大鼠滑膜組織由1～2 層滑膜細胞構成，分布緊密、整齊，無炎癥細胞的浸潤及血管增生；模型組大鼠滑膜組織排列紊亂、增生明顯，多達5～6層排列，且組織水腫嚴重，周圍可見大量炎性細胞浸潤、血管增生現象，在軟骨面，還可見部分軟骨細胞增生。四大血低劑量組較模型組的滑膜組織有所改善，增生及炎細胞浸潤現象均減少；而四大血中劑量、高劑量及陽性藥物組則能明顯改善滑膜組織病理狀況，僅可見少量的炎性細胞浸潤及新生組織血管，增生較少，沒有明顯的軟骨及骨組織的破壞。結果提示四大血能較好地改善CIA模型大鼠關節組織病理狀況，且高劑量組改善明顯。見圖1。

2.5 大鼠滑膜組織NF-κB p65免疫組織化學觀察切片中染色為棕黃色的細胞即可視為陽性細胞，其胞質及胞核都可見染色，但胞核染色較深。模型組大鼠關節滑膜中可見強陽性，并可見滑膜位置有增生和損傷，而空白組未見陽性區域。經陽性藥物雷公藤和四大血治療后，NF-κB p65表達下降(F=67.776，P<0.05)；且四大血高、中劑量組與陽性藥物比較差異無統計學意義。見圖2、3。

2.6 大鼠滑膜組織NF-κB p65、IκB-α蛋白的表達大鼠滑膜組織NF-κB p65、IκB-α蛋白表達水平見圖4、5。分子量約65、39 ku處清晰可見NF-κB p65及IκB-α蛋白條帶。模型組NF-κB p65蛋白表達量明顯高于空白組；而相較于模型組，四個給藥組表達量下降，其中高劑量組和陽性藥物組差異有統計學意義(F=47.154，P<0.01)。模型組抑制蛋白IκB-α的下降與空白組的差異有統計學意義，而各治療組較模型組蛋白表達量上調(F=12.420，P<0.01)。而與陽性藥物組比較，四大血高、中劑量組差異無統計學意義。

圖2 各組大鼠NF-κB p65表達情況

A:模型組；B：空白組；C：陽性藥物組；D：四大血高劑量組；E：四大血中劑量組；F：四大血低劑量組；與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01；與陽性藥物組比較：▲▲P<0.01

圖3 各組大鼠NF-κB p65免疫組織化學染色 ×400

A：空白組；B：模型組；C：四大血低劑量組；D：四大血中劑量組；E：四大血高劑量組；F：陽性藥物組

圖4 各組大鼠NF-κB p65、IκB-α蛋白表達

A：四大血高劑量組；B：四大血中劑量組；C：四大血低劑量組；D：陽性藥物組；E：空白組；F:模型組

圖5 各組大鼠NF-κB p65、IκB-α蛋白的表達

與空白組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01；與陽性藥物組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01

3 討論

類風濕性關節炎是一種可導致關節炎癥及其功能障礙的免疫性疾病，其主要病理特征表現為：大量炎性細胞浸潤及滑膜、血管增生，并導致血管翳形成及軟骨和骨的損壞等，最終可表現為關節的畸形[6]。本實驗利用牛Ⅱ型膠原造模后，大鼠足跖部出現了明顯腫脹及行走不穩，AI評分發現其產生了繼發性影響，提示造模成功。經四大血治療3周后，HE染色可看出模型組大鼠滑膜組織水腫及增生明顯，且其周圍有大量炎性細胞浸潤，而經治療后的大鼠，能明顯改善滑膜組織病理變化，僅可見少量的炎性細胞浸潤及新生組織血管，增生較少，沒有明顯的軟骨及骨組織的破壞。

研究[7]證實多種促炎細胞因子介導的炎癥反應在滑膜的病變過程中起重要作用。而NF-κB是參與炎癥細胞因子表達的主要轉錄因子之一，在RA發病機制中起關鍵的調控作用[8]。IL-17是一種較強炎性細胞因子，高水平的IL-17可通過促進IκB的磷酸化而激活NF-κB信號通路，活化的NF-κB促進輔助性T淋巴細胞(helper T cell, Th)向Th1細胞轉化，使成纖維細胞大量分泌炎性因子IL-6和IL-8，進而促使Th17分泌IL-17，進一步加重類RA癥狀[9]。本實驗檢測IL-17表達量的變化，結果顯示，模型組 IL-17含量較空白組顯著升高，而經四大血治療后，各組大鼠IL-17含量下降，且四大血中、高劑量組與陽性藥物組接近，提示四大血治療RA作用可能與其抑制炎性因子 IL-17表達相關。而在IHC和Western blot的結果中， 各治療組較模型組NF- κB p65表達減少，IκB-α表達增強，提示四大血可能抑制了NF-κB信號通路的活化。本研究提示四大血可明顯改善CIA大鼠相關癥狀，而這可能與抑制NF-κB的活化過程，降低IL-17表達，而下降的IL-17又進一步抑制NF-κB的活化，由此形成的良性循環有關。但是本研究結果僅僅是初步提示，關于其具體影響信號轉導通路的機制仍不明確，還有待后期進一步研究。