低氘水對肺癌細胞Caspase-3表達的影響

焦 敏，李 敏，萬凱華，楊 勁，李 巖

通常把氘體積分數低于0.015%(150 ppm)的水稱為低氘水( deuterium depleted water, DDW)[1]。自然界中的生物，其氘含量并不是個定值，范圍約從 120～160 ppm，自然界中的DDW主要存在于冰川中，喜馬拉雅冰川水氘含量約為 130 ppm。自然界的水中氘的含量約為 150 ppm[2]。1990 年匈牙利國立研究所報道 DDW 能誘導寵物貓和狗自發性惡性腫瘤完全或部分消退[3]，并注冊申請其為動物臨床抗腫瘤藥物。俄羅斯醫學科學院癌癥科研所與醫學生物問題研究所進行的動物實驗研究[4-5]表明，長期飲用DDW可在一定程度上延長動物的壽命。Tyrysov et al[6]研究結果也得出，飲用氘含量低的水能顯著減小鼠肺癌細胞移植瘤體積并延長宮頸癌移植小鼠的壽命。

細胞凋亡是一個復雜的級聯式基因表達過程，而半胱天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine protease protein,Caspase-3)蛋白是細胞凋亡過程中的核心調控蛋白[7]，其表達水平的高低與細胞凋亡密切相關，該文通過實驗研究DDW對肺癌細胞A549體外增殖抑制作用，觀察處理后細胞的抑制率、細胞凋亡變化、檢測凋亡蛋白Caspase-3的表達水平，為今后DDW保健用品的開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料DDW(體積分數為0.005%)購自新疆阿克特冰泉科技有限公司；胎牛血清、RPMI 1640培養基粉末購自美國Gibco公司；肺癌細胞A549購自中科院上海細胞庫；CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；抗體Caspase-3購自美國Cell Signaling Techonlogy；ECL顯色試劑購自美國Thermo公司。

1.2 細胞培養肺癌細胞A549培養在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液、5%CO2、37 ℃條件下培養。DDW實驗組50、75、100 ppm，對照組為正常 RPMI 1640培養液培養的細胞。

1.3 CCK-8法檢測腫瘤細胞的增殖活性用CCK-8試劑盒對細胞增殖進行測定肺癌細胞接種96孔培養板中，24 h培養后，棄去原來培養基，加入由DDW配制的培養基，設3個復孔，分別培養12、24、48、72 h后，每孔分別加入10 μl CCK-8溶液繼續培養3 h，在酶標儀上進行選擇490 nm波長檢測，測定各孔的光密度(optical denisity，OD)值。結果取3次實驗平均值。計算DDW對細胞的抑制率，抑制率(%)=(1-實驗組OD/對照組OD)×100%。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡將肺癌細胞A549接種于6孔板，每孔接種細胞1×104/ml。37 ℃、5% CO2培養24 h后加入不同濃度的DDW (實驗分為對照組和實驗組，實驗組加入不同濃度的DDW 50、75、100 ppm配制的培養基。對照組為正常 RPMI 1640配制的培養基。繼續培養72 h后，棄去培養基，用PBS清洗3次，將細胞重懸于1×結合緩沖液中使細胞濃度為1×106/ml。吸取100 μl細胞懸液于5 ml培養管中，加入5 μl PE+5 μl 7-AAD 后渦旋細胞，在室溫黑暗處孵育15 min。每孔加入400 μl 1×結合緩沖液吹打收集的細胞后過200目尼龍篩，1 h內測定熒光強度。實驗重復3次。

1.5 RT-PCR檢測Caspase-3基因表達

1.5.1總RNA提取 將肺癌細胞接種于6孔板，每孔接種細胞1×104/ml。37 ℃、5% CO2培養24 h后加入不同濃度的DDW (實驗分為對照組和實驗組，實驗組加入不同濃度的DDW 50、75、100 ppm配制的培養基。對照組為正常 RPMI 1640培養液培養的細胞。繼續培養72 h后，棄去培養基，加PBS清洗3次。每個孔各加入1 ml TRIzol靜置30 min后用槍頭混勻吹打，吸至無RNase酶的EP管中，加入氯仿0.2 ml輕微震蕩15 s后，靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min后，取上清液。加入0.5 ml異丙醇，輕輕混勻后靜置10 min，4 ℃、 12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入1 ml 75%乙醇(應現配現用)洗滌沉淀，4 ℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清液。室溫干燥15 min后，加入20 μl無RNase酶的無菌水，立即測定RNA濃度。

1.5.2逆轉錄 用Thermo逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，嚴格按照說明書進行操作，整個過程均在冰上進行。配制逆轉錄反應液，立即放入PCR儀中進行逆轉錄，反應結束得到總cDNA后，立即進行實時定量熒光PCR(RT-PCR)或-20 ℃保存。

1.5.3RT-PCR 嚴格按說明書配制RT-PCR反應液，反應體系為20 μl，操作過程均在冰上進行。用熒光定量試劑盒進行RT-PCR檢測。PCR條件：95 ℃、10 min，40個循環：95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，4 ℃ ∞。β-actin作為內參， Capsase-3上游序列：5′-TTGAGACAGACAGTGGTGTTGATGATG-3′,下游序列：5′-ATAATAACCAGGTGCTGTGGAGTATGC-3′，樣品目的基因的相對表達率(relative quantitation，RQ)采用ΔΔCt方法計算，RQ=2-ΔΔCt(表示實驗組目的基因的表達相對于對照組的變化倍數)，ΔΔA Ct=-(Ct目的基因-Ct內參)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參)對照組。

1.6 Western blot檢測Caspase-3蛋白的水平收集不同濃度DDW處理72 h后的細胞，提取細胞總蛋白，經BCA法定量蛋白，按抗體分子質量要求配置分離膠和濃縮膠，每孔10 μl蛋白樣品上樣，電泳電壓80 V,電泳20 min后改為100 V，電泳2 h，轉膜電壓為100 V，電泳2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST洗膜10 min×3 次，孵Caspase-3一抗(1 ∶1 000)4 ℃過夜，TBST洗膜10 min×3 次，辣根過氧化酶標記的二抗(1 ∶5 000)室溫避光孵育2 h，ECL顯色拍照，以 β-actin 為內參蛋白，目的蛋白相對含量用目的蛋白/內參的灰度值表示。

2 結果

2.1 DDW對肺癌細胞增殖活性的影響用不同濃度的DDW培養肺癌細胞A549，含50、 75、100 ppm DDW的培養基培養12 h對肺癌細胞的抑制率為10.59%、9.03%、3.97%；24 h的抑制率為13.62%、8.9%、7.8%；48 h的抑制率為15.74%、9.19%、9.31%；72 h的抑制率為19.42%、11.71%、7.05%。各實驗組與對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05,P<0.01)，見表1。

2.2 DDW對肺癌細胞凋亡作用的影響不同濃度的DDW培養肺癌細胞A549后，晚期凋亡和總凋亡顯著增加。含50、75、100 ppm DDW的培養基培養72 h對肺癌細胞的總凋亡率分別為( 22.8±0.95)%、(16.9±0.49)%、(11.3±0.32)%，顯著高于對照組(1.1±0.2)%(P<0.05)。見圖1。

表1 不同濃度DDW對肺癌細胞A549增殖抑制的影響

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖1 流式細胞術檢測DDW對肺癌細胞A549凋亡的影響

2.3 DDW對肺癌細胞中Caspase-3基因表達的影響用50、75、100 ppm DDW的培養基培養肺癌細胞(A549)72 h后 Caspase-3 mRNA的相對表達量分別為(1.256±0.067)、(1.114±0.037)、(1.058±0.022)。與正常培養基相比，Caspase-3 mRNA的相對表達量明顯升高(P<0.01)，見圖2。

2.4 DDW對肺癌細胞中Caspase-3蛋白表達的影響用50、75、100 ppm DDW的培養基培養肺癌細胞(A549)72 h后，Western blot法檢測發現DDW能夠明顯上調A549細胞中Caspase-3蛋白的表達。與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

圖2 DDW對Caspase-3 mRNA表達的影響

A:50 ppm；B:75 ppm；C:100 ppm；D:對照組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 Western blot法檢測Caspase-3蛋白表達水平

A:50 ppm； B:75 ppm； C:100 ppm； D:對照組；與對照組比較：**P<0.01

3 討論

凋亡是細胞生命體自行結束的方式，凋亡細胞最后可被吞噬細胞或鄰近細胞吞噬，不會引起炎性反應。因此，誘導腫瘤細胞凋亡對抗腫瘤有著重要的意義，細胞凋亡的發生是細胞色素C從線粒體釋放，繼而激活Caspase,最終導致凋亡[7]。其中Caspase-3被認為是凋亡反應的執行者，在細胞凋亡過程中起一個中心作用，它能通過降解細胞內相應位置使細胞凋亡。在分子水平上Caspase-3的表達和活性的增加將導致細胞凋亡[8-10]。本實驗通過流式細胞術檢測DDW主要影響早期凋亡、RT-PCR和Western blot驗證Caspase-3在DDW處理后的肺癌細胞有強的表達，對照組細胞呈弱或陰性的表達。結果顯示DDW能顯著抑制肺癌的增殖，上調Caspase-3活性，其中50 ppm DDW作用較顯著，提示DDW促凋亡作用與激活Caspase依賴的凋亡途徑有關，揭示DDW輔助抗癌作用機制與凋亡蛋白Casapse-3有關。