miR-9-5p對前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

郭 亮，肖 峻，陶 陶

前列腺癌(prostate cancer,PCA)是最常見的癌癥之一，也是全世界尤其是發達國家男性癌癥死亡的第二大原因。大多數患者最初對雄激素剝奪療法(ADT)敏感，然而逐漸對ADT無效，最終演變為去勢抗性前列腺癌(CRPC)[1]。CRPC難以治療，且容易發生骨轉移等，一旦發生轉移預后極差[2]。因此，深入了解PCA轉移的分子機制將有助于提高PCA的治療。微小RNA (microRNA, miRNA) 是一類進化上保守的非編碼小分子RNA，具有在轉錄水平調控基因表達的功能,通過調控關鍵基因的表達參與多種細胞活動，包括腫瘤的發生和轉移[3]。已有多項報道顯示miR-9-5p與肺癌[4]、乳腺癌[5]、口腔鱗狀細胞癌[6]、骨肉瘤[7]等腫瘤均存在相關性，在肺癌中具有促癌的作用，而在口腔鱗狀細胞癌中具有抑癌作用。該研究通過real-time PCR分析了前列腺上皮細胞和前列腺癌細胞中miR-9-5p的表達水平，并在前列腺癌細胞中過表達miR-9-5p，觀察miR-9-5p對前列腺癌細胞增殖、侵襲和轉移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人永生化前列腺上皮細胞RWPE-1、前列腺癌細胞PC3和DU145均購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心；FBS、RPMI1640培養基、KSF培養基、胰酶、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)和牛腦垂體提取物(bovine pituitary extract,BPE)均購自美國Gibco公司；攜帶has-miR-9-5p的慢病毒(miR-9-5p)和陰性對照慢病毒(miR-NC)購自上海漢恒生物科技有限公司；Polybrene和Puromycin購自美國Sigma公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；MMLV Reverse Transcriptase試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；GenePharma Hairpin-it TM microRNA RT-PCR Quantitation Kit和miR-9-5p mimic購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；Transwell小室(8 μm)和Matrigel基質膠購自美國Corning公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；DualLuciferase Reporter Assay System購自美國Promega公司；二氧化碳培養箱購自日本SANYO公司；Real-time PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；Nanodrop 2000微量分光光度計購自美國Thermo公司；酶標儀購自美國Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 RWPE-1用含EGF、BPE、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的KSF培養基，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中進行培養。PC3和DU145使用含10%FBS、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養基培養。

1.2.2穩定表達miR-9-5p細胞株的建立 向24孔板每孔接種5×104個PC3細胞，培養過夜。次日棄去培養基，用含10%FBS的RPMI1640培養基稀釋病毒并加入終濃度為10 mg/L的Polybrene，每孔加入2 ml稀釋病毒液使得感染復數(multiplicity of infection, MOI)為20，于37 ℃、5% CO2的培養箱中繼續培養24 h，換成新鮮培養基繼續培養72 h，改用含Puromycin的培養基持續培養2周，篩選出穩定表達miR-9-5p的PC3細胞(PC3/miR-9-5p)，同時制備穩定感染陰性對照慢病毒的PC3細胞(PC3/miR-NC)，在熒光顯微鏡下觀察確定細胞表達綠色熒光，通過熒光定量PCR檢測細胞中miR-9-5p的表達水平。

1.2.3RNA提取和熒光定量PCR 細胞總RNA提取按照TRIzol說明書進行，用Nanodrop 2000微量分光光度計檢測A260和A280，計算純度和含量；使用MMLV Reverse Transcriptase試劑盒(大連寶生物公司)將總RNA轉錄成cDNA。再采用GenePharma Hairpin-it TM microRNA RT-PCR Quantitation Kit檢測miR-9-5p。PCR反應在ABI StepOne Plus系統上進行，反應條件：95 ℃、10 min為預變性階段條件；95 ℃、12 s，62 ℃、40 s，共40個循環的擴增階段條件；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s為溶解曲線階段條件。以U6作為內參，2-ΔΔCT法計算miR-9-5p的相對表達量。對于CXCR4 mRNA的定量檢測同樣在ABI StepOne Plus系統上進行，反應條件為50 ℃、2 min，95 ℃、10 min為預變性階段條件；95 ℃、20 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40個循環。以GAPDH作為內參，2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。擴增使用的引物為CXCR4 (accession number: NM_000201)F：5′-ATGCCCAGACATCTGTGTCC-3′，R：5′-GGGGTCTCTATGCCCAACAA-3′; U6 snRNA(accession number: NR_004394) F:5′-GCTTCGGCAGCACATA-3′，R：5′-ATGGAACGCTTCACGA-3′; GAPDH F：5′-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3′，R：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.2.4細胞增殖能力檢測 細胞增殖能力檢測使用CCK-8試劑盒進行分析。將處于對數生長期的各組細胞用胰酶消化后按照2 000個細胞/孔接種96孔板，孵育過夜，每孔加入10 μl CCK-8溶液，于接種細胞后0、24、48、72、96 h通過酶標儀檢測A450值，評價細胞增殖能力。每個時間點檢測6個復孔，細胞增殖能力與A450值呈正相關性。

1.2.5細胞遷移和侵襲力檢測 細胞用胰酶消化后用不含血清的培養基稀釋細胞，將細胞濃度調整至3×105個/ml，每孔接種0.1 ml至覆蓋或不覆蓋基質膠的48孔Transwell膜上，在下方加入0.6 ml含10%FBS的培養基，對于遷移實驗則繼續培養24 h；對于侵襲實驗則繼續培養24 h；隨后將細胞固定，用0.1%結晶紫染色，在顯微鏡下計數不同組穿膜的細胞數目。

1.2.6生物信息學分析 通過TargetScan7.1(http://www.targetscan.org/)、PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu/)、miRanda (http://www.microrna.org/)三種軟件分析miR-9-5p與CXCR43’-UTR的結合位點。

1.2.7雙螢光素酶報告基因分析 從通用生物技術有限公司購買包含野生型CXCR43’-UTR及預測與miR-9-5p結合位點突變的CXCR43’-UTR熒光素酶報告基因質粒pGL3-CXCR4和mut-pGL3-CXCR4。將293T細胞接種至24孔板，過夜培養后將熒光素酶報告基因質粒、內參質粒(Renilla luciferase)和miR-9-5p mimic或對照同時轉染細胞。48 h后根據DualLuciferase Reporter Assay System的說明書操作裂解細胞，加入發光液后在酶標儀上檢測。利用海腎素熒光作為內參照對結果進行均一化處理。

2 結果

2.1 熒光定量PCR檢測miR-9-5p在RWPE-1、PC3和DU145細胞中的表達熒光定量PCR檢測顯示miR-9-5p在RWPE-1細胞中表達水平最高為(116.3±4.99)，DU145次之，為(42.30±2.66)，PC3最低為(23.47±2.43)。PC3細胞中miR-9-5p的表達量顯著低于RWPE-1(t=16.72,P=0.000 1)和DU145(t=5.22,P=0.016)，因此選擇PC3細胞進行后續試驗。見圖1。

圖1 熒光定量PCR檢測miR-9-5p在RWPE-1、PC3和DU145細胞中的表達

A：miR-9-5p在不同細胞中的表達水平；B：PCR擴增的溶解曲線；與PC3比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 熒光定量PCR檢測miR-9-5p在PC3細胞中過表達熒光定量PCR檢測顯示穩定轉染miR-9-5p的PC3/miR-9-5p細胞中miR-9-5p的表達量為(165.20±5.78)，而在PC3/miR-NC細胞中表達量為(25.47±5.78)(t=22.42,P<0.000 1)，在PC3細胞中表達量為(25.56±3.01)(t=21.43,P<0.0001)，差異有統計學意義。見圖2。

2.3 miR-9-5p抑制PC3細胞增殖CCK-8法檢測各組細胞的增殖情況顯示，與細胞對照及慢病毒對照組相比，miR-9-5p能顯著抑制PC3細胞的增殖。見圖3。

2.4 miR-9-5p抑制PC3細胞的遷移和侵襲Transwell實驗結果顯示PC3、PC3/miR-NC和PC3/miR-9-5p組遷移細胞計數分別是(1 194.05±82.33)、(1 189.33±95.97)、(461.30±49.97)，與PC3和PC3/miR-NC組相比，PC3/miR-9-5p細胞遷移數目顯著減少(F=265.31，P<0.0001)。PC3、PC3/miR-NC和PC3/miR-9-5p組侵襲細胞計數分別是(786.30±42.45)、(816.31±17.34)、(197.14±45.02)，與PC3和PC3/miR-NC組相比，PC3/miR-9-5p細胞遷移數目顯著減少(F=281.24，P<0.000 1)。見圖4。

圖2 熒光定量PCR鑒定miR-9-5p在PC3細胞中過表達

A：miR-9-5p在不同細胞中的表達水平；B：PCR擴增的溶解曲線；1：PC3/miR-9-5p細胞；2：PC3/miR-NC細胞；3：PC3細胞；與PC3/miR-9-5p細胞比較：**P<0.01

圖3 miR-9-5p能夠抑制PC3細胞增殖

2.5 miR-9-5p能夠靶向作用于CXCR4 3’-UTR抑制CXCR4的表達通過生物信息學預測顯示miR-9-5p能夠靶向結合CXCR4的3’-UTR(圖5A)；雙熒光素酶報告基因分析顯示，miR-9-5p能夠靶向作用于CXCR4的3’-UTR抑制螢光素酶表達，當對CXCR4的3’-UTR域進行點突變處理后，miR-9-5p的抑制作用消失(圖5B、5C)。熒光定量PCR檢測的結果顯示，在過表達miR-9-5p的PC3/miR-9-5p細胞中，CXCR4的表達水平顯著低于PC3細胞(t=8.14,P=0.001 2)和PC3/miR-NC細胞(t=11.38,P=0.000 3)(圖5D)。

圖4 miR-9-5p抑制PC3細胞的遷移和侵襲

A：細胞遷移(24 h)；B：細胞侵襲(48 h)；1：PC3; 2:PC3/miR-NC；3：PC3/miR-9-5p;C：細胞遷移計數比較；D：細胞侵襲計數比較；a：PC3/miR-9-5p細胞；b：PC3/miR-NC細胞；c：PC3細胞；與PC3/miR-9-5p細胞比較：**P<0.01

圖5 miR-9-5p靶向作用于CXCR4 3’-UTR抑制CXCR4的表達

A：生物信息學預測miR-9-5p靶向結合CXCR4的3’-UTR；B：雙熒光素酶報告基因分析示意圖；C：雙熒光素酶報告基因檢測結果；D：熒光定量PCR檢測CXCR4 mRNA的表達水平；1：PC3細胞；2：PC3/miR-NC細胞；3：PC3/miR-9-5p細胞；與PC3細胞比較：**P<0.01；與PC3/miR-NC細胞比較：##P<0.01

3 討論

越來越多的證據表明異常表達的miRNA通過干擾miRNA /蛋白質編碼基因調控網絡引起腫瘤的發生、發展和轉移[8]。鑒定異常表達的miRNAs是闡明miRNA引起腫瘤的第一步。一些臨床研究已經表明在PCA存在大量異常表達的miRNAs，其中一部分作為癌基因或抑癌基因發揮重要作用[9]。越來越多的研究顯示在多種腫瘤中miR-9-5p起著抑癌基因的作用，例如在口腔鱗狀細胞癌患者外周血中miR-9-5p的表達水平顯著下降[6]；在骨肉瘤中由于miR-9-5p表達水平下降，導致其靶基因POU2F1的表達水平上升，從而促進了腫瘤的進展[7]。此外，在肝臟星狀細胞中miR-9-5p能夠靶向作用于TGFBR1和TGFBR2抑制肝臟纖維化的進展[10]。在TGF-β誘導的人真皮成纖維細胞纖維化過程中miR-9-5p能夠靶向作用于TGFBR2，抑制其表達，從而抑制纖維化的進展[11]。

趨化因子(CXCL)及其受體(CXCR)在多種細胞過程中發揮著重要作用，近期的研究[12]顯示其也參與了腫瘤的發生和發展。CXCRs在多種腫瘤類型中均高表達，包括乳腺癌、PCA、胰腺癌、肺癌和卵巢癌等[13]。CXCR4已被證實在癌癥的發展中具有重要作用，并可作為各種癌癥的預后標志物[14]。一些研究顯示CXCR4在PCA中高表達，并與預后差密切相關，且參與PCA細胞的增殖、遷移和侵襲[15]。

本研究比較了正常PCA細胞RWPE-1以及PCA細胞株PC3和DU145，發現RWPE-1中miR-9-5p的表達水平顯著高于PC3和DU145。通過慢病毒構建了穩定表達miR-9-5p的PC3細胞株，發現過表達miR-9-5p的PC3細胞(PC3/miR-9-5p)的增殖能力較慢病毒PC3/miR-9-5p和正常PC3顯著降低。Transwell細胞遷移和侵襲實驗顯示過表達miR-9-5p也可以顯著降低PC3細胞的遷移和侵襲能力。通過生物信息學軟件預測發現miR-9-5p能夠靶向作用于CXCR4的3’-UTR，雙熒光素酶報告基因的結果證實預測結果是正確的。在過表達miR-9-5p中CXCR4的mRNA水平顯著下降了。上述實驗結果表明miR-9-5p在PCA中可能通過靶向作用于CXCR4的3’-UTR，下調CXCR4表達，抑制腫瘤的增殖、遷移和侵襲。

總之，本研究結果顯示miR-9-5p可能通過下調CXCR4表達抑制PCA的增殖、遷移和侵襲。分析miR-9-5p調控PCA細胞生物學功能對PCA的診斷、治療及預后評價有重要意義。