利用基因表達(dá)芯片探索多發(fā)性硬化的關(guān)鍵基因和通路

黃 帆，唐玉蘭，廖韋靜，鄺慧敏，藍(lán) 嵐

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性和神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)生是由遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[1]。在西方國家MS是造成青壯年神經(jīng)性殘疾中僅次于外傷的第二大因素，據(jù)2013年統(tǒng)計，估計全球約有230萬人患有MS，患病率約為(50～300)人/10萬，且由于印度和中國等大型人群相對缺乏數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)可能被低估[2]。早期MS的特征通常是神經(jīng)功能缺損急性發(fā)作，其依賴于中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性炎癥性脫髓鞘病變的區(qū)域及炎癥反應(yīng)的程度，而導(dǎo)致病變髓鞘再生的形成機(jī)制尚未完全了解。位于主要染色體6p21中組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)區(qū)域內(nèi)的人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)等位基因，已被確定為該疾病的主要遺傳決定因素。另外，已經(jīng)描述了超過100種非MHC MS的易感性變體，攜帶已知的易感性變體相關(guān)基因參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化或信號傳導(dǎo)[3]。不恰當(dāng)?shù)脑\斷標(biāo)準(zhǔn)用于不典型癥狀的脫髓鞘患者是導(dǎo)致其誤診的主要原因,遺傳研究的目標(biāo)是實現(xiàn)更精確的表示疾病發(fā)病機(jī)制中的相關(guān)基因、通路和網(wǎng)絡(luò)，并利用這些信息發(fā)現(xiàn)預(yù)防、治療和修復(fù)的新靶點(diǎn)。

該研究擬基于GEO基因表達(dá)數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析多發(fā)性硬化疾病狀態(tài)，構(gòu)建基因網(wǎng)絡(luò)并篩選潛在的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，為尋找MS發(fā)病機(jī)制提供新途徑，或許可以用于早期診斷多發(fā)性硬化并為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫隸屬于美國國立衛(wèi)生研究院的美國國立生物技術(shù)信息中心，是高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)和雜交陣列、芯片、微陣列的數(shù)據(jù)庫。以“Multiple Sclerosis”為搜索詞進(jìn)入數(shù)據(jù)庫獲取基因表達(dá)譜GSE21942，種屬為人類，芯片平臺GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。該芯片數(shù)據(jù)包括14例多發(fā)性硬化患者及15例健康人的基因表達(dá)陣列數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達(dá)基因(differentially-expressed genes,DEGs)處理使用R語言和Bioconductorhttp://www.bioconductor.org/)進(jìn)行基因芯片數(shù)據(jù)分析。利用GPL570平臺對應(yīng)的hgu133plus2.db注釋R包進(jìn)行基因探針注釋，取每個探針的最大值作為該探針的表達(dá)值，除去無法注釋的探針。通過穩(wěn)健多元陣列平均(robust multivariate array average，RMA)對原始表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，背景校正和歸一化處理。按照|log2FC|>1和P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，使用limma包篩選14名正常人樣本和15名多發(fā)性硬化患者樣本基因得出88個DEGs，繪制DEGs熱圖和火山圖。

1.3 樣本的主成分分析主成分分析可將高維數(shù)據(jù)處理成低維數(shù)據(jù)，利用R語言factoextra包對DEGs數(shù)據(jù)集進(jìn)行主成分分析。

1.4 樣本的聚類分析聚類分析是一種無監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)分析方法，可以把相似的對象分成不同的組別或更多的子集。利用R語言cluster包進(jìn)行聚類分析，并利用factoextra包將聚類分析結(jié)果可視化處理。

1.5 基因本體論和pathway分析DEGs將獲得的DEGs通過在線軟件數(shù)據(jù)庫(DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行注釋、可視化分析，以確定過度表現(xiàn)的GO類別和Pathway生物通路。GO分析可以確定大量基因的生物學(xué)意義，并對基因產(chǎn)物功能進(jìn)行分類，包括生物過程(biological processes，BP)、分子功能(molecular functions，MF)和細(xì)胞組分(cellular components，CC)。通過Pathway生物通路富集分析，篩選的基因可能與兩個或更多信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)，由于不同途徑中的基因相同，因此途徑之間的重疊是不可避免的。基于KEGG數(shù)據(jù)庫對DEGs進(jìn)行基因信號通路富集分析，選擇DEGs富集最顯著的10個功能進(jìn)行排序并分析。

1.6 蛋白-蛋白相互作用信號網(wǎng)絡(luò)分析DEGs用于檢索交互基因/蛋白質(zhì)的搜索工具(STRING)數(shù)據(jù)庫(http://string.embl.de/)提供了PPI的關(guān)鍵評估和整合，用于評估直接(物理)和間接(功能)關(guān)聯(lián)的DEGs。本研究通過STRING數(shù)據(jù)庫繪制靶基因編碼蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，以便了解差異基因之間的相互調(diào)控關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 DEGs數(shù)據(jù)對數(shù)化標(biāo)準(zhǔn)處理前后的多發(fā)性硬化組和健康對照組基因芯片數(shù)據(jù)結(jié)果見圖1、2，可知本研究標(biāo)本經(jīng)對數(shù)化處理后數(shù)據(jù)均一性較好，兩組之間具有可比性。

圖1 樣本芯片數(shù)據(jù)對數(shù)化標(biāo)準(zhǔn)處理前

圖2 樣本芯片數(shù)據(jù)對數(shù)化標(biāo)準(zhǔn)處理后

2.2 DEGs篩選結(jié)果通過對兩組數(shù)據(jù)的DEGs進(jìn)行篩選，構(gòu)建火山圖并顯示88個DEGs(圖3A)，與對照組比較，多發(fā)性硬化組上調(diào)基因76個、下調(diào)基因12個，圖3C顯示了上調(diào)基因和下調(diào)基因中有顯著差異的10個；88個基因構(gòu)建的熱圖(圖4)，其中橫坐標(biāo)表示15個MS組和14個健康組樣本；紅色代表上調(diào)的基因，綠色代表下調(diào)的基因，差異越大，顏色越深。

2.3 樣本聚類分析通過R語言factoextra包的增強(qiáng)聚類分析函數(shù)對差異基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行層次聚類，自動計算最佳聚類簇兩簇，并且對結(jié)果進(jìn)行可視化處理(圖5)。此聚類結(jié)果表明，篩選的差異基因能較好的區(qū)分出健康組和MS組。

2.4 DEGs數(shù)據(jù)集主成分分析使用R語言FactoMineR包對差異基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行主成分分析，實現(xiàn)高維數(shù)據(jù)降維成為簡化的數(shù)據(jù)，用factoextra包可視化主成分分析結(jié)果(圖6A、B)，主要有貢獻(xiàn)率最大的兩個主成分，主成分分析結(jié)果能較好地區(qū)分健康組和MS組(圖6C)。

2.5 DEGs GO分析結(jié)果采用線軟件數(shù)據(jù)庫(DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)對DEGs進(jìn)行GO功能富集分析，生物學(xué)過程中，富含MS中DEGs的GO術(shù)語包括固有免疫反應(yīng)、血液凝固、體液免疫反應(yīng)和氧轉(zhuǎn)運(yùn)。在細(xì)胞組分類別中，富含GO的術(shù)語主要是血紅蛋白復(fù)合物、質(zhì)膜和細(xì)胞外間隙。在分子功能分類中，包括蛋白結(jié)合，血紅素結(jié)合和跨膜信號受體活性(圖 7)；從紅色到藍(lán)色，顏色越藍(lán)，表示負(fù)相關(guān)程度越大；顏色越紅，表示正相關(guān)程度越大(圖8)。

2.6 DEGs pathway分析結(jié)果表1顯示了4個差異最顯著的富集通路，其主要涉及造血細(xì)胞譜系、B細(xì)胞受體信號通路、破骨細(xì)胞分化、氮代謝等。

2.7 DEGs信號網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果利用STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異基因所編碼的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，可得出27個蛋白存在相互作用(圖9)。圖9A是差異基因表達(dá)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，圖9B所示的是互作網(wǎng)絡(luò)中篩選出的核心基因節(jié)點(diǎn)數(shù)，其中節(jié)點(diǎn)數(shù)≥4的DEGs，如HBD、IL-8、SNCA、ALAS2等。

圖3 DEGs的火山圖

A：所有樣本基因；紅色：上調(diào)基因，藍(lán)色：下調(diào)基因；B：88個DEGs；紅色：76上調(diào)基因；綠色：12個下調(diào)基因；C：最顯著上調(diào)、下調(diào)的前10基因；紅色：上調(diào)基因；綠色：下調(diào)基因

圖4 差異基因表達(dá)值參差聚類熱圖

圖5 聚類分析圖

表1 DEGs的KEGG通路分析

3 討論

MS的特征在于脫髓鞘和進(jìn)行性神經(jīng)功能障礙，既往研究報道了線粒體參與MS中的神經(jīng)變性和殘疾，包括核編碼的電子傳遞鏈亞基基因的表達(dá)降低和呼吸復(fù)合物的抑制[4]。本研究中通過使用微陣列的方法從基因水平揭示MS發(fā)病機(jī)制可能涉及的關(guān)鍵基因：ALAS2、CA1、SNCA、HBB、IL8等。其中血紅蛋白亞基β(亦稱β-珠蛋白,hemoglobin-β,HBB)與α珠蛋白(HBA)一起構(gòu)成成人中最常見的血紅蛋白形式HbA,血紅蛋白是一種可以誘導(dǎo)局部氧化應(yīng)激，炎癥和組織損傷的反應(yīng)性分子[5]，變異的血紅蛋白表達(dá)可能與各種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)[6]；HBB被發(fā)現(xiàn)在MS大腦病變皮層分離的線粒體部分中水平增加，被認(rèn)為可能是將神經(jīng)元能量學(xué)與細(xì)胞核中組蛋白的表觀遺傳變化聯(lián)系起來的機(jī)制的一部分，并且可以通過支持神經(jīng)元代謝在MS中提供神經(jīng)保護(hù)[7]。碳酸酐酶(carbonic anhydrase 1,CA1)通過激肽釋放酶原激活和絲氨酸蛋白酶因子XIIa生成來介導(dǎo)出血性視網(wǎng)膜和腦血管通透性，這些現(xiàn)象誘發(fā)增殖性糖尿病性視網(wǎng)膜病變和糖尿病性黃斑水腫疾病進(jìn)展，是視力喪失的主要原因[8]，這可能與多發(fā)性硬化臨床表現(xiàn)中的視力受損發(fā)生機(jī)制相關(guān)。α-突觸核蛋白(alpha-synuclein,SNCA)的過量產(chǎn)生可能是帕金森病的致病因素，其主要存在于神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元)的突觸前末端，通過聚集突觸小泡在維持突觸前終末突觸小泡的供應(yīng)方面發(fā)揮作用[9]，它也可能有助于調(diào)節(jié)多巴胺的釋放。白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)是先天免疫系統(tǒng)反應(yīng)中免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)，其分泌增加了氧化應(yīng)激，從而引起炎癥細(xì)胞的募集和誘導(dǎo)氧化應(yīng)激介質(zhì)的進(jìn)一步增加，使其成為局部炎癥的關(guān)鍵因素[10]；IL-8也被稱為嗜中性粒細(xì)胞趨化因子，能誘導(dǎo)靶細(xì)胞趨化，主要是嗜中性粒細(xì)胞以及其他粒細(xì)胞，導(dǎo)致它們向感染部位遷移，IL-8在抵達(dá)后也會誘導(dǎo)吞噬作用；研究發(fā)現(xiàn)，MS患者腦脊液中IL-8的水平顯著高于對照組，血清IL-8水平顯著低于對照組，這些差異可能與血腦屏障的損傷有關(guān)[11]。由此，本文篩選的DEGs可能在MS發(fā)病相關(guān)的炎癥反應(yīng)或神經(jīng)退行性過程中扮演重要角色。

圖6 樣本和DEGs數(shù)據(jù)集主成分分析

A：DEGs數(shù)據(jù)集主成分分析；B：樣本數(shù)據(jù)集主成分分析；C：樣本數(shù)據(jù)集主成分分析(左側(cè)為健康組，右側(cè)為MS組)

圖7 GO功能富集分析差異基因

圖8 差異基因GO功能富集分析

圖9 差異基因表達(dá)蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)及核心基因節(jié)點(diǎn)數(shù)

A：DEGs蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)分析；B：DEGs共表達(dá)顯著差異的節(jié)點(diǎn)數(shù)

通過對DEGs進(jìn)行GO分析顯示，二者差異最顯著的功能主要涉及體液免疫反應(yīng)、固有免疫反應(yīng)、蛋白結(jié)合、血紅素結(jié)合和跨膜信號受體活性等方面。通過對二者進(jìn)行pathway分析發(fā)現(xiàn)，其差異最顯著富集通路主要涉及造血細(xì)胞譜系、B細(xì)胞受體信號通路、破骨細(xì)胞分化、氮代謝等方面。小膠質(zhì)細(xì)胞屬于成體組織中存在的髓系細(xì)胞譜系，其在器官發(fā)生過程中從不同于造血干細(xì)胞的卵黃囊紅細(xì)胞-骨髓祖細(xì)胞(yolk-sac erythro-myeloid progenitors，EMPs)發(fā)育而來，研究顯示：BRAF(V600E)在小鼠EMP中的鑲嵌表達(dá)導(dǎo)致組織駐留巨噬細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增和嚴(yán)重的遲發(fā)性神經(jīng)退行性疾病[12]。部分研究[13]已經(jīng)證明，在特定條件下Tregs可以產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，其中自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞對髓鞘自身抗原發(fā)生免疫應(yīng)答參與發(fā)病過程，自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞等也參與免疫損傷作用。Strom et al[14]利用基于ApoE-/-小鼠頸動脈周圍的血管周圍環(huán)的放置的新內(nèi)膜形成模型來確定B細(xì)胞和B細(xì)胞亞群是否賦予針對損傷發(fā)展的保護(hù)，結(jié)果顯示源自淋巴結(jié)的B2-B細(xì)胞或純化的CD21(hi)CD23(hi)CD24(hi)B細(xì)胞向同基因小鼠的繼發(fā)性轉(zhuǎn)移減少了損傷大小和炎癥，而不改變血清膽固醇水平，IL-10阻斷或轉(zhuǎn)移IL-10缺陷型B細(xì)胞阻止了淋巴結(jié)衍生的B細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)，這可能為多發(fā)性硬化中的免疫調(diào)節(jié)方法開辟道路。Niedziela et al[15]通過評估血清一氧化氮及其反應(yīng)性衍生物(NOx)作為復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化患者的氮類和炎癥參數(shù)之一，并比較各種類型的減少一氧化氮和炎性生物標(biāo)志物的疾病緩解療法的有效性，在一線藥物治療的受試者中證實血清NOx水平和MS持續(xù)時間之間呈負(fù)相關(guān)。隨后的前瞻性研究將需要進(jìn)一步確定這些核心基因在MS發(fā)病機(jī)制中的功能。

2017年修訂版MS診斷標(biāo)準(zhǔn)提出，應(yīng)結(jié)合MRI和血清學(xué)檢測及臨床特征和病史，探索特發(fā)性炎癥疾病的差異診斷，包括視神經(jīng)脊髓炎譜系障礙以及其他可以類似MS的復(fù)發(fā)性疾病。視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病和 MS同為中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，二者的臨床表現(xiàn)和影像學(xué)特征相似，但治療策略卻有所不同，如預(yù)防MS復(fù)發(fā)的疾病修飾治療(如β干擾素、芬戈莫德、那他珠單抗)可加重視神經(jīng)脊髓炎[16]。因此，篩選識別期生物靶標(biāo)，結(jié)合基因功能和參與的通路分析，有助于研究疾病的發(fā)病機(jī)制，為盡早確診及制定治療方案提供判別依據(jù)。