固相萃取UPLC-MS/MS測定黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑

公丕學，廉貞霞，薛霞，宿書芳，孫珊珊，程志，王駿，劉艷明，*

（1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250100；2.山東省藥學科學院，山東 濟南 250100）

黃酒是一種以稻米為原料釀制成的糧食酒，是中國最古老的飲料酒，也是世界三大釀造酒之一。黃酒沒有經過蒸餾，酒精含量低于20%[1]。黃酒中主要使用的食品添加劑為焦糖色，種類不同的黃酒呈現出米色、黃褐色或紅棕色，焦糖色是一種被允許廣泛用于食品及飲料中使用的著色劑[2]，在生產氨法焦糖色和亞硫酸銨法焦糖色時會產生4-甲基咪唑。研究發現，4-甲基咪唑能導致動物長腫瘤，也有可能給人體帶來致癌風險[3]，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在世界衛生組織國際癌癥研究機構公布的致癌物2B 類致癌物清單中[4]。歐盟食品安全委員會允許在食物中添加含有4-甲基咪唑的焦糖色素，但每千克不能超過200 mg。我國GB 1886.64-2015《食品安全國家標準食品添加劑焦糖色》中規定，4-甲基咪唑在液體食品中含量小于0.02%，與世界衛生組織限量要求相同[5]。

黃酒中含有氨基酸、多酚、類黑精、谷胱甘肽等生理活性成分，容易干擾測定，因此樣品處理中提取凈化是難點[1]。樣品提取、凈化方法主要有溶劑提取QuEchers 法[6]和固相萃取法[7]等。檢測甲基咪唑的方法有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[8-9]、液相色譜法[10-13]、氣相色譜-質譜聯用法[14-16]、液相色譜-質譜聯用法[17-21]、拉曼光譜法[22]、酶聯免疫法[23]、分光光度法[24-25]、電化學色譜法[26-27]、毛細管電泳法[28]等。目前，對于黃酒中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑則沒有相關檢測方法和數據。液相色譜串聯質譜法具有液相色譜的高效分離能力和四級桿質譜的定性定量能力，因此液相色譜串聯質譜法被廣泛應用于食品有毒有害物質的分離分析檢測。

本試驗建立一種定性定量準確的超高效液相色譜串聯質譜法同時測定黃酒中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑，定量評價目標物及同位素內標在黃酒中的基質效應，使用陽離子固相萃取方法對黃酒進行凈化，提取和濃縮2-甲基咪唑及4-甲基咪唑，同時結合親水作用色譜（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）的保留模式，對于黃酒中2-甲基咪唑及4-甲基咪唑達到完全的色譜分離效果，實現準確的定性定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2-甲基咪唑標準品、4-甲基咪唑標準品、4-甲基咪唑-D6 標準品：德國Dr.Ehrenstorfer 公司；甲醇、乙腈、甲酸銨：色譜純，德國Merck 公司；三氯乙酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；MCX 固相萃取柱（3 mL/60 mg）、ACQUITY UPLC BEH Amide（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、ACQUITY UPLC HSS T3（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、ACQUITY UPLC BEH HILIC（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）：美國 Waters 公司。

1.2 儀器與設備

Waters ACQUITY 超高效液相色譜儀：美國Waters公司；AB SCIEX Triple Quad 5500 三重四極桿質譜分析儀[配有電噴霧離子源（electron spray lonization，ESI）及MultiQuant 數據處理系統]：美國SCIEX 公司；MS-3旋渦混合器：德國IKA 公司；SB-800DTD 超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；3-18k 高速冷凍離心機：德國SIGMA 公司；Milli-Q 超純水機：美國Millipore 公司；N-EVAP-45 溫控氮吹儀：美國 Organomation 公司。

1.3 標準溶液配制

標準物質儲備液：分別稱取適量的2-甲基咪唑標準品和4-甲基咪唑標準品，用乙腈配成1 mg/mL 的標準物質儲備液，4 ℃避光貯存。

同位素內標儲備液：分別稱取適量的4-甲基咪唑-D6 標準品，用乙腈配成1 mg/mL 的標準貯備液，4 ℃避光貯存。

系列標準工作溶液配制：準確移取1 mg/mL 混合標準中間溶液和1 mg/mL 4-甲基咪唑-D6 標準中間溶液適量，用乙腈-10 mmol/L 甲酸銨溶液（95∶5，體積比）稀釋，配制成 0.1、1、10、20、50、100、500、1 000 ng/mL系列濃度的混合標準工作溶液，其中4-甲基咪唑-D6濃度為10 ng/mL，供液相色譜-串聯質譜測定。

1.4 方法

提取：稱取2.0 g 黃酒于50 mL 塑料離心管中，加入100 μL 100 ng/mL 同位素內標工作溶液，加入10 mL 1%三氯乙酸，超聲15 min，8 000 r/min 離心5 min，取出待凈化。

凈化：MCX 固相萃取柱依次用6 mL 甲醇，6 mL水活化，取待凈化溶液上柱，控制流速1 mL/min，待上樣完成后分別用5 mL 2%甲酸淋洗，5 mL 甲醇淋洗，然后用9 mL 5%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液在45 ℃恒溫水浴中氮吹至洗脫液近干，定量加入1.0mL 乙腈-10 mmol/L 甲酸銨溶液（95∶5，體積比）復溶，超聲溶解，過0.22 μm 有機濾膜，濾液供超高效液相色譜串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）測定。

1.4.1 色譜條件

色譜柱：BEH HILIC；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：2.0 μL；流動相：A：10 mmol/L 甲酸銨，B：乙腈，梯度洗脫程序見表1所示。

1.4.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測；氣簾氣：20.0 L/h，碰撞氣：8 L/h，離子噴霧電壓：5 000 V，離子源溫度：500 ℃，噴霧氣：50 L/h，輔助加熱氣：50 L/h。

表1 流動相梯度程序Table 1 Gradient program for mobile phase

1.4.3 基質效應評價

樣品基質效應的存在明顯影響質譜方法定量的準確性，因此有必要對建立的質譜方法進行基質效應考察。在經過樣品前處理后加入標樣，通過比較，可以定量評價目標物的基質效應。為了評估黃酒樣品在提取凈化處理后的基質效應，可以通過比較相同濃度的目標物在標準溶液和黃酒處理液中響應值。可以通過公式1計算：

式中：A 為標準溶液中分析物的峰面積；B 為樣品處理液中分析物的峰面積。

在不含2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的黃酒樣品中加入與標準溶液相同濃度的標準物質。如果基質效應約等于0 %，說明沒有基質效應；如果基質效應大于0 %，說明出現了離子抑制效應，即基質抑制；如果基質效應小于0 %，說明出現了離子增強效應，即基質增強。

2 結果與分析

2.1 固相萃取柱的優化

由于2-甲基咪唑和4-甲基咪唑化合物分子較小（結構式見圖1），但極性很大，在樣品中含量范圍較寬，所以如何快速、準確地檢測出其含量就成為研究的重點。

圖1 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的結構式Fig.1 Chemical structure formula of 2-methimazole and 4-methylimidazole

為了提高試驗的靈敏度和準確度，分別試驗了不同類型的固相萃取柱Bond Elut C1（8C18）、Waters OASIS MCX（MCX）、Waters OASIS HLB（HLB）、和 Waters OASIS MAX（MAX）對2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的回收率，用10 ng/mL 兩種目標物標準溶液過固相萃取柱得到回收率如圖2所示，結果表明使用Waters OASIS MCX（MCX）固相萃取柱時回收率最好，因此Waters OASIS MCX（MCX）固相萃取柱被用于后續試驗前處理樣品凈化步驟中。

圖2 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑通過不同固相萃取柱的回收率Fig.2 The recoveries of 2-methylimidazole and 4-methylimidazoleon different solid-phase extraction（SPE）columns

2.2 固相萃取柱洗脫條件的優化

考察了固相萃取柱洗脫液甲醇中氨水體積分數對2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的洗脫能力，結果見圖3。

圖3 洗脫液中氨水比例優化Fig.3 Optimization of solid-phase extraction（SPE）condition

在洗脫液中氨水體積分數對目標物洗脫有較大影響，目標物回收率隨氨水體積分數增加而增加，當體積分數達到5%時回收率最高，當氨水體積分數升高時，回收率略有降低。當氨水體積分數為5%時回收率最高，表明此時洗脫能力最強，因此選擇體積分數5%氨水作為洗脫溶液。

2.3 基質效應評價結果分析

在不含2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的黃酒樣品中加入與標準溶液相同濃度的標準物質。如果基質效應約等于0 %，說明沒有基質效應；如果基質效應大于0%，說明出現了離子抑制效應，即基質抑制；如果基質效應小于0%，說明出現了離子增強效應，即基質增強。

通過1.4.3 基質效應評價公式計算黃酒樣品對目標物的基質效應，200 ng/mL 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑標準溶液的基質效應分別為52.1%和54.5%，說明黃酒樣品對目標物有抑制，純標樣外標法定量樣品含量偏差較大，該分析方法不適合選擇外標法定量方式。

結果表明黃酒樣品對目標物有基質抑制的作用，因此選擇定量方式為同位素內標法定量，比外標法定量更準確，建立的方法能對黃酒中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑能夠準確定量。

2.4 色譜分離條件的優化

試驗中采用ESI+模式，使用易揮發的甲酸銨流動相能提高2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的離子化效率，響應信號強度增加，提高靈敏度，因此在流動相中加入10 mmol/L 的甲酸銨，以提高目標化合物的離子化效率和改善峰形，故本試驗選用乙腈-10 mmol/L 甲酸銨為流動相體系。

2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在4 根色譜柱的分離結果如圖4所示。

圖4 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在4 種色譜柱分離效果Fig.4 Separation effect of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole on 4 chromatographic columns

通過幾種色譜柱分析結果可以看出，BEH HILIC色譜柱在分離兩種目標化合物時有較好的分離度和更好的峰形，而兩種化合物在BEH Amide 色譜柱的峰型有明顯拖尾和色譜峰展寬現象，BEH C18和HSS T3色譜柱出峰時間較早，無法對兩種化合物進行有效分離，無法進行定性和定量，故本試驗采用BEH HILIC色譜柱進行分離檢測。2-甲基咪唑和4-甲基咪唑分子分子量較小、極性較大，與反相色譜柱中固定相之間的相互作用力較弱，不容易保留，一般會在流動相中使用離子對試劑來增加目標物保留，但是流動相中含有離子對試劑時在儀器及色譜柱平衡時間較長，最關鍵是離子對試劑進入質譜后容易造成污染，給質譜分析帶來困難。HILIC 模式色譜分離方法能夠對強極性分子有較好的保留，所用流動相比較簡單，能夠與質譜更好兼容，對2-甲基咪唑和4-甲基咪唑分離效果更好，靈敏度更高。

2.5 質譜條件的優化

2-甲基咪唑和4-甲基咪唑均含一個仲氨基基團和一個叔氨基基團，在ESI 源電離下容易獲取H+，形成[M+H]+準分子離子峰，因此本試驗中選用ESI 源正離子多反應監測式檢測。為了使化合物具有較高的靈敏度，在做一級質譜掃描時，通過優化電離源參數毛細管電壓和錐孔電壓，使母離子響應強度最大；在做二級質譜掃描時，在碰撞氣和碰撞電壓的作用下能夠使目標化合物發生斷裂或重排，從而產生不同的碎片離子。在碰撞作用下甲基咪唑分別丟失一個-C2H3和一個-C3H5N，甲基咪唑分別對應產生m/z 56 和m/z 28的碎片離子。碎片離子分別作為目標化合物的定性與定量離子對，并優化各自碰撞電壓，使兩對子離子響應最強。2-甲基咪唑，4-甲基咪唑及同位素內標物的關鍵質譜參數見表2。

2.6 方法的線性范圍和檢出限

以目標化合物豐度較高定量離子峰面積與內標物峰面積比值為縱坐標，以對應2-甲基咪唑和4-甲基咪唑標準工作溶液的濃度（ng/mL）為橫坐標，繪制標準工作曲線，得出線性回歸方程、線性相關系數、檢出限（以信號與噪音比值S/N≥3 作為檢出限計算）等，結果見表3。標準溶液定性離子色譜圖見圖5，定量離子色譜圖見圖6。

表2 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑及同位素內標關鍵質譜參數Table 2 The optimized mass spectrometry（MS）parameters of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole and internal standard（IS）

表3 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑線性方程、線性相關系數和檢出限Table 3 Linear equations，correlation coefficients and limits ofdetection of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

圖5 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑定性離子（82.9＞28）色譜圖Fig.5 Qualitative ions（82.9 ＞ 28）chromatograms of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

2.7 方法的回收率和精密度

采用兩種不同類型黃酒樣品，進行添加回收率和精密度的試驗。黃酒樣品中分別添加10、50、100 μg/kg和500 μg/kg 4 個濃度水平，按照建立的方法進行處理，每個理論添加水平平行測定6 次。同時使用標準溶液進行回收率和相對標準偏差計算，結果見表4。2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的回收率在96.3%～106.0%。每個添加水平平行測定6 次，測定結果表明相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為 3.5%～6.1%。結果表明，本試驗方法能夠用于實際樣品檢測。

2.8 實際樣品測定

用本文建立的方法對市場上購買的10 批次黃酒樣品進行檢測，檢測結果見表5。

圖6 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑定量離子色譜圖（82.9＞55.9）Fig.6 Quantitative ion chromatograms（82.9 ＞ 55.9）of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

表4 添加回收率與精密度（n=6）Table 4 Recovery and RSD for the determination of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole（n=6）

表5 黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑檢出情況Table 5 Detection of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in yellow wine

本文首次報道了黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的含量，其中2-甲基咪唑含量最高為205.635 μg/kg，4-甲基咪唑含量最高為1 030.012 μg/kg。本次所檢樣品含量均低于所允許使用的最大限量200 mg/kg。

3 結論

通過優化試驗條件，選擇1%三氯乙酸提取，MCX固相萃取柱，能夠提高方法的準確性及靈敏度，選擇分離效果較好的BEH HILIC 色譜柱，并對基質效應進行了定量評價，建立了穩定同位素內標稀釋超高效液相色譜-串聯質譜法測定黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的可靠定量分析方法。

本方法具有線性范圍寬，穩定性好，定性、定量準確等優點，適用于不同類型黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的定性確證與定量檢測，可以為政府監管提供技術支持和數據積累。