固相萃取UPLC-MS/MS測定黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑

公丕學，廉貞霞，薛霞，宿書芳，孫珊珊，程志，王駿，劉艷明，*

（1.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250100；2.山東省藥學科學院，山東 濟南 250100）

黃酒是一種以稻米為原料釀制成的糧食酒，是中國最古老的飲料酒，也是世界三大釀造酒之一。黃酒沒有經(jīng)過蒸餾，酒精含量低于20%[1]。黃酒中主要使用的食品添加劑為焦糖色，種類不同的黃酒呈現(xiàn)出米色、黃褐色或紅棕色，焦糖色是一種被允許廣泛用于食品及飲料中使用的著色劑[2]，在生產(chǎn)氨法焦糖色和亞硫酸銨法焦糖色時會產(chǎn)生4-甲基咪唑。研究發(fā)現(xiàn)，4-甲基咪唑能導(dǎo)致動物長腫瘤，也有可能給人體帶來致癌風險[3]，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)公布的致癌物2B 類致癌物清單中[4]。歐盟食品安全委員會允許在食物中添加含有4-甲基咪唑的焦糖色素，但每千克不能超過200 mg。我國GB 1886.64-2015《食品安全國家標準食品添加劑焦糖色》中規(guī)定，4-甲基咪唑在液體食品中含量小于0.02%，與世界衛(wèi)生組織限量要求相同[5]。

黃酒中含有氨基酸、多酚、類黑精、谷胱甘肽等生理活性成分，容易干擾測定，因此樣品處理中提取凈化是難點[1]。樣品提取、凈化方法主要有溶劑提取QuEchers 法[6]和固相萃取法[7]等。檢測甲基咪唑的方法有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[8-9]、液相色譜法[10-13]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-16]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[17-21]、拉曼光譜法[22]、酶聯(lián)免疫法[23]、分光光度法[24-25]、電化學色譜法[26-27]、毛細管電泳法[28]等。目前，對于黃酒中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑則沒有相關(guān)檢測方法和數(shù)據(jù)。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有液相色譜的高效分離能力和四級桿質(zhì)譜的定性定量能力，因此液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法被廣泛應(yīng)用于食品有毒有害物質(zhì)的分離分析檢測。

本試驗建立一種定性定量準確的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定黃酒中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑，定量評價目標物及同位素內(nèi)標在黃酒中的基質(zhì)效應(yīng)，使用陽離子固相萃取方法對黃酒進行凈化，提取和濃縮2-甲基咪唑及4-甲基咪唑，同時結(jié)合親水作用色譜（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）的保留模式，對于黃酒中2-甲基咪唑及4-甲基咪唑達到完全的色譜分離效果，實現(xiàn)準確的定性定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2-甲基咪唑標準品、4-甲基咪唑標準品、4-甲基咪唑-D6 標準品：德國Dr.Ehrenstorfer 公司；甲醇、乙腈、甲酸銨：色譜純，德國Merck 公司；三氯乙酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；MCX 固相萃取柱（3 mL/60 mg）、ACQUITY UPLC BEH Amide（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、ACQUITY UPLC HSS T3（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、ACQUITY UPLC BEH HILIC（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）：美國 Waters 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters ACQUITY 超高效液相色譜儀：美國Waters公司；AB SCIEX Triple Quad 5500 三重四極桿質(zhì)譜分析儀[配有電噴霧離子源（electron spray lonization，ESI）及MultiQuant 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)]：美國SCIEX 公司；MS-3旋渦混合器：德國IKA 公司；SB-800DTD 超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；3-18k 高速冷凍離心機：德國SIGMA 公司；Milli-Q 超純水機：美國Millipore 公司；N-EVAP-45 溫控氮吹儀：美國 Organomation 公司。

1.3 標準溶液配制

標準物質(zhì)儲備液：分別稱取適量的2-甲基咪唑標準品和4-甲基咪唑標準品，用乙腈配成1 mg/mL 的標準物質(zhì)儲備液，4 ℃避光貯存。

同位素內(nèi)標儲備液：分別稱取適量的4-甲基咪唑-D6 標準品，用乙腈配成1 mg/mL 的標準貯備液，4 ℃避光貯存。

系列標準工作溶液配制：準確移取1 mg/mL 混合標準中間溶液和1 mg/mL 4-甲基咪唑-D6 標準中間溶液適量，用乙腈-10 mmol/L 甲酸銨溶液（95∶5，體積比）稀釋，配制成 0.1、1、10、20、50、100、500、1 000 ng/mL系列濃度的混合標準工作溶液，其中4-甲基咪唑-D6濃度為10 ng/mL，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4 方法

提取：稱取2.0 g 黃酒于50 mL 塑料離心管中，加入100 μL 100 ng/mL 同位素內(nèi)標工作溶液，加入10 mL 1%三氯乙酸，超聲15 min，8 000 r/min 離心5 min，取出待凈化。

凈化：MCX 固相萃取柱依次用6 mL 甲醇，6 mL水活化，取待凈化溶液上柱，控制流速1 mL/min，待上樣完成后分別用5 mL 2%甲酸淋洗，5 mL 甲醇淋洗，然后用9 mL 5%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液在45 ℃恒溫水浴中氮吹至洗脫液近干，定量加入1.0mL 乙腈-10 mmol/L 甲酸銨溶液（95∶5，體積比）復(fù)溶，超聲溶解，過0.22 μm 有機濾膜，濾液供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）測定。

1.4.1 色譜條件

色譜柱：BEH HILIC；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：2.0 μL；流動相：A：10 mmol/L 甲酸銨，B：乙腈，梯度洗脫程序見表1所示。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；氣簾氣：20.0 L/h，碰撞氣：8 L/h，離子噴霧電壓：5 000 V，離子源溫度：500 ℃，噴霧氣：50 L/h，輔助加熱氣：50 L/h。

表1 流動相梯度程序Table 1 Gradient program for mobile phase

1.4.3 基質(zhì)效應(yīng)評價

樣品基質(zhì)效應(yīng)的存在明顯影響質(zhì)譜方法定量的準確性，因此有必要對建立的質(zhì)譜方法進行基質(zhì)效應(yīng)考察。在經(jīng)過樣品前處理后加入標樣，通過比較，可以定量評價目標物的基質(zhì)效應(yīng)。為了評估黃酒樣品在提取凈化處理后的基質(zhì)效應(yīng)，可以通過比較相同濃度的目標物在標準溶液和黃酒處理液中響應(yīng)值。可以通過公式1計算：

式中：A 為標準溶液中分析物的峰面積；B 為樣品處理液中分析物的峰面積。

在不含2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的黃酒樣品中加入與標準溶液相同濃度的標準物質(zhì)。如果基質(zhì)效應(yīng)約等于0 %，說明沒有基質(zhì)效應(yīng)；如果基質(zhì)效應(yīng)大于0 %，說明出現(xiàn)了離子抑制效應(yīng)，即基質(zhì)抑制；如果基質(zhì)效應(yīng)小于0 %，說明出現(xiàn)了離子增強效應(yīng)，即基質(zhì)增強。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取柱的優(yōu)化

由于2-甲基咪唑和4-甲基咪唑化合物分子較小（結(jié)構(gòu)式見圖1），但極性很大，在樣品中含量范圍較寬，所以如何快速、準確地檢測出其含量就成為研究的重點。

圖1 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure formula of 2-methimazole and 4-methylimidazole

為了提高試驗的靈敏度和準確度，分別試驗了不同類型的固相萃取柱Bond Elut C1（8C18）、Waters OASIS MCX（MCX）、Waters OASIS HLB（HLB）、和 Waters OASIS MAX（MAX）對2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的回收率，用10 ng/mL 兩種目標物標準溶液過固相萃取柱得到回收率如圖2所示，結(jié)果表明使用Waters OASIS MCX（MCX）固相萃取柱時回收率最好，因此Waters OASIS MCX（MCX）固相萃取柱被用于后續(xù)試驗前處理樣品凈化步驟中。

圖2 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑通過不同固相萃取柱的回收率Fig.2 The recoveries of 2-methylimidazole and 4-methylimidazoleon different solid-phase extraction（SPE）columns

2.2 固相萃取柱洗脫條件的優(yōu)化

考察了固相萃取柱洗脫液甲醇中氨水體積分數(shù)對2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的洗脫能力，結(jié)果見圖3。

圖3 洗脫液中氨水比例優(yōu)化Fig.3 Optimization of solid-phase extraction（SPE）condition

在洗脫液中氨水體積分數(shù)對目標物洗脫有較大影響，目標物回收率隨氨水體積分數(shù)增加而增加，當體積分數(shù)達到5%時回收率最高，當氨水體積分數(shù)升高時，回收率略有降低。當氨水體積分數(shù)為5%時回收率最高，表明此時洗脫能力最強，因此選擇體積分數(shù)5%氨水作為洗脫溶液。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評價結(jié)果分析

在不含2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的黃酒樣品中加入與標準溶液相同濃度的標準物質(zhì)。如果基質(zhì)效應(yīng)約等于0 %，說明沒有基質(zhì)效應(yīng)；如果基質(zhì)效應(yīng)大于0%，說明出現(xiàn)了離子抑制效應(yīng)，即基質(zhì)抑制；如果基質(zhì)效應(yīng)小于0%，說明出現(xiàn)了離子增強效應(yīng)，即基質(zhì)增強。

通過1.4.3 基質(zhì)效應(yīng)評價公式計算黃酒樣品對目標物的基質(zhì)效應(yīng)，200 ng/mL 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑標準溶液的基質(zhì)效應(yīng)分別為52.1%和54.5%，說明黃酒樣品對目標物有抑制，純標樣外標法定量樣品含量偏差較大，該分析方法不適合選擇外標法定量方式。

結(jié)果表明黃酒樣品對目標物有基質(zhì)抑制的作用，因此選擇定量方式為同位素內(nèi)標法定量，比外標法定量更準確，建立的方法能對黃酒中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑能夠準確定量。

2.4 色譜分離條件的優(yōu)化

試驗中采用ESI+模式，使用易揮發(fā)的甲酸銨流動相能提高2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的離子化效率，響應(yīng)信號強度增加，提高靈敏度，因此在流動相中加入10 mmol/L 的甲酸銨，以提高目標化合物的離子化效率和改善峰形，故本試驗選用乙腈-10 mmol/L 甲酸銨為流動相體系。

2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在4 根色譜柱的分離結(jié)果如圖4所示。

圖4 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在4 種色譜柱分離效果Fig.4 Separation effect of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole on 4 chromatographic columns

通過幾種色譜柱分析結(jié)果可以看出，BEH HILIC色譜柱在分離兩種目標化合物時有較好的分離度和更好的峰形，而兩種化合物在BEH Amide 色譜柱的峰型有明顯拖尾和色譜峰展寬現(xiàn)象，BEH C18和HSS T3色譜柱出峰時間較早，無法對兩種化合物進行有效分離，無法進行定性和定量，故本試驗采用BEH HILIC色譜柱進行分離檢測。2-甲基咪唑和4-甲基咪唑分子分子量較小、極性較大，與反相色譜柱中固定相之間的相互作用力較弱，不容易保留，一般會在流動相中使用離子對試劑來增加目標物保留，但是流動相中含有離子對試劑時在儀器及色譜柱平衡時間較長，最關(guān)鍵是離子對試劑進入質(zhì)譜后容易造成污染，給質(zhì)譜分析帶來困難。HILIC 模式色譜分離方法能夠?qū)姌O性分子有較好的保留，所用流動相比較簡單，能夠與質(zhì)譜更好兼容，對2-甲基咪唑和4-甲基咪唑分離效果更好，靈敏度更高。

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2-甲基咪唑和4-甲基咪唑均含一個仲氨基基團和一個叔氨基基團，在ESI 源電離下容易獲取H+，形成[M+H]+準分子離子峰，因此本試驗中選用ESI 源正離子多反應(yīng)監(jiān)測式檢測。為了使化合物具有較高的靈敏度，在做一級質(zhì)譜掃描時，通過優(yōu)化電離源參數(shù)毛細管電壓和錐孔電壓，使母離子響應(yīng)強度最大；在做二級質(zhì)譜掃描時，在碰撞氣和碰撞電壓的作用下能夠使目標化合物發(fā)生斷裂或重排，從而產(chǎn)生不同的碎片離子。在碰撞作用下甲基咪唑分別丟失一個-C2H3和一個-C3H5N，甲基咪唑分別對應(yīng)產(chǎn)生m/z 56 和m/z 28的碎片離子。碎片離子分別作為目標化合物的定性與定量離子對，并優(yōu)化各自碰撞電壓，使兩對子離子響應(yīng)最強。2-甲基咪唑，4-甲基咪唑及同位素內(nèi)標物的關(guān)鍵質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.6 方法的線性范圍和檢出限

以目標化合物豐度較高定量離子峰面積與內(nèi)標物峰面積比值為縱坐標，以對應(yīng)2-甲基咪唑和4-甲基咪唑標準工作溶液的濃度（ng/mL）為橫坐標，繪制標準工作曲線，得出線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限（以信號與噪音比值S/N≥3 作為檢出限計算）等，結(jié)果見表3。標準溶液定性離子色譜圖見圖5，定量離子色譜圖見圖6。

表2 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑及同位素內(nèi)標關(guān)鍵質(zhì)譜參數(shù)Table 2 The optimized mass spectrometry（MS）parameters of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole and internal standard（IS）

表3 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑線性方程、線性相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 3 Linear equations，correlation coefficients and limits ofdetection of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

圖5 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑定性離子（82.9＞28）色譜圖Fig.5 Qualitative ions（82.9 ＞ 28）chromatograms of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

2.7 方法的回收率和精密度

采用兩種不同類型黃酒樣品，進行添加回收率和精密度的試驗。黃酒樣品中分別添加10、50、100 μg/kg和500 μg/kg 4 個濃度水平，按照建立的方法進行處理，每個理論添加水平平行測定6 次。同時使用標準溶液進行回收率和相對標準偏差計算，結(jié)果見表4。2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的回收率在96.3%～106.0%。每個添加水平平行測定6 次，測定結(jié)果表明相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為 3.5%～6.1%。結(jié)果表明，本試驗方法能夠用于實際樣品檢測。

2.8 實際樣品測定

用本文建立的方法對市場上購買的10 批次黃酒樣品進行檢測，檢測結(jié)果見表5。

圖6 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑定量離子色譜圖（82.9＞55.9）Fig.6 Quantitative ion chromatograms（82.9 ＞ 55.9）of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

表4 添加回收率與精密度（n=6）Table 4 Recovery and RSD for the determination of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole（n=6）

表5 黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑檢出情況Table 5 Detection of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in yellow wine

本文首次報道了黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的含量，其中2-甲基咪唑含量最高為205.635 μg/kg，4-甲基咪唑含量最高為1 030.012 μg/kg。本次所檢樣品含量均低于所允許使用的最大限量200 mg/kg。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化試驗條件，選擇1%三氯乙酸提取，MCX固相萃取柱，能夠提高方法的準確性及靈敏度，選擇分離效果較好的BEH HILIC 色譜柱，并對基質(zhì)效應(yīng)進行了定量評價，建立了穩(wěn)定同位素內(nèi)標稀釋超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的可靠定量分析方法。

本方法具有線性范圍寬，穩(wěn)定性好，定性、定量準確等優(yōu)點，適用于不同類型黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的定性確證與定量檢測，可以為政府監(jiān)管提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)積累。